[发明专利]登革2型病毒NS5蛋白C端截短片段及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和病毒免疫学诊断领域，具体地说，涉及一种登革2型病毒NS5蛋白C端截短片段及其制备方法与应用。

背景技术

世界卫生组织(WHO)数据显示，在过去约七十年间，登革热(Dengue fever，DF)已成为疫情发展最快的蚊媒传染疾病，常年危及着生活在热带、亚热带128个国家和地区约20～50亿人的生命安全。DF发病率在过去40年中激增了30多倍，在全球范围内呈上升态势，并且正频繁地往美国、南欧以及澳洲这些非病区扩散。每年有5千万至1亿人感染登革病毒(Dengue virus，DENV)。DENV感染人体后可引起自限性DF以及临床症状较为严重的登革出血热(Dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克综合征(Dengue shock syndrome，DSS)，而后两者每年导致约5万人住院治疗，死亡率为2.5％。绝大部分登革热患者的病情都比较轻。不过约有10％的患者会发展为严重的DHF/DSS，此外有少部分患者甚至会因为血管通透性过高出血而死亡。

目前尚且认为登革病毒有四个型别，均可感染人，其中2型重症率及死亡率均高于其他型别。人群对任何一型DENV的初次感染均较敏感，感染后获得对同型病毒比较持久的免疫力，一般保持1～4年，而对异型病毒的免疫力则很短暂，只维持2～12个月。因而感染一个型别DENV后还可能发生二次或连续感染即继发性感染，而继发性异型感染很可能引起DHF/DSS，从而引发相当高的发病率和病死率。其发生机制在于抗体依赖的感染增强(Antibody dependent enhancement，ADE)效应，即在继发性异型感染中预先存在的交叉抗体能够与病毒结合，通过抗体与靶细胞表面的Fc受体的相互作用促进病毒对单核细胞、巨噬细胞以及成熟DC细胞的感染，进而引起血液浓缩、出血或便血甚至休克等临床症状。

2015年12月9日，由法国药企赛诺菲巴斯德研发的全球第一支嵌合黄热病登革热四价疫苗在墨西哥上市。该疫苗使用一种来自黄热病17D减毒活疫苗病毒的感染性克隆来构建四种嵌合病毒，每一种病毒只表达四种血清型登革病毒之一的包膜蛋白(E蛋白)和前膜蛋白(prM/M蛋白)。这一严重威胁全世界数千万人健康的疾病即将得到遏制，人们似乎看到了曙光。但马来西亚Sarawak州在2007年暴发了一次登革热疫情，美国德克萨斯大学医学中心(University of Texas Medical Branch in Galveston)的病毒学家Nikos Vasilakis经全基因组测序发现这是一株新的登革病毒新发现的登革病毒在人群中流行的可能性将会引起ADE效应，所以人们对该疫苗仍持谨慎态度。

DENV感染个体中抗体类型的研究显示，初次感染者体内产生针对于该型病毒的结构蛋白及非结构蛋白的抗体类群中，该型特异性中和抗体比例占主要地位，并集中于E蛋白表位。而在继发性感染中，交叉型抗体占据主要地位，且其针对表达更多集中于prM蛋白区域。与此相似的是，登革病毒特异T细胞反应在继发性异型感染中也出现广泛的交叉。由此我们发现，ADE效应多与病毒的结构蛋白E和prM有关，而非结构蛋白可能不会产生ADE效应。

目前尚无抗DENV药物，感染后的快速诊断和对症治疗尤为重要。预防和控制DENV的传播主要依靠蚊媒控制，对于DF和DHF还只能对症治疗。根据国家卫生和计划生育委员会《登革热诊疗指南(2014年第2版)》，“根据流行病学史、临床表现及实验室检查结果，可作出登革热的诊断。在流行病学史不详的情况下，根据临床表现、辅助检查和实验室检测结果作出诊断。”目前，实验室常用的几种检测DF的方法有实时荧光PCR检测DENV核酸，采用免疫层析法检测DENV特异性NS1抗原和IgM/IgG抗体等。从确诊病人在DF不同病程血清中核酸、NS1抗原和IgM/IgG抗体的阳性率各指标变化趋势可见，现有的任何单一实验室指标检测均不足以提供有效、可靠的诊断，需要两种以上指标共用才具有可靠性，这无疑延迟了诊断时间，增加了检测成本。由于DF的治疗方法对于各型DENV尚无分型，都只是对症治疗，因而实现其快速诊断显得尤为重要。DENV的快速诊断不仅有助于控制疫情，而且能够给予患者对症支持治疗，有利于疾病恢复，减少DHF/DSS的发生，降低死亡率。