[发明专利]流式细胞术检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的方法

说明书

本发明公开了一种流式细胞术检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的方法，包括以下步骤：鸡处死后，获取胸腺组织并制取单细胞悬液；取所述单细胞悬液，加入抗鸡的CD3、CD4和CD8单克隆抗体各一头份，旋涡混匀，于4℃避光染色；取染色后的细胞液，用PBS洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；分析检测结果，获得鸡胸腺T淋巴细胞亚群比例。本发明流式细胞术检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的方法，针对样本处理、检测及分析过程中目标细胞选取、补偿调节及参数选择的问题，建立了一种稳定规范的鸡胸腺T淋巴细胞亚群的检测方法。

技术领域

本发明属于细胞检测技术领域，具体地说，涉及一种流式细胞术检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的方法。

背景技术

流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种利用流式细胞仪进行单细胞定量分析和分选的技术。其工作原理是通过荧光标记的单克隆抗体或荧光微球，对单个细胞或分子进行标记或捕获后，进行多参数的定量分析。在检测过程中，通过非荧光散射信号，即前向散射光FSC和侧向散射光SSC信号，可分别获得与细胞大小和胞内物质密度相关的信息，从而对细胞进行分群，这一细胞分群处理过程可以为下一步分析特定靶细胞群的特点奠定基础。

流式细胞分析最大的优点是对混合细胞群中各亚群细胞进行分类计数。在人类医学中，人外周血T淋巴细胞亚群(包括CD3、CD4和CD8细胞)检测结果与患者细胞免疫功能密切相关。例如，可通过CD3⁺CD4⁺CD8^-T淋巴细胞的绝对数量和相对比例来诊断艾滋病。胸腺是T淋巴细胞增殖分化的场所，因此检测鸡胸腺T淋巴细胞各亚群的构成情况，可用于科学研究中评估鸡T淋巴细胞在胸腺的分化成熟速度和程度。研究发现，样本前处理、目标细胞选取、电压调节、荧光补偿调节、分析时阳性范围及参数选择等均会影响检测结果，而目前尚无使用流式细胞仪检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的可靠参考方法。

发明内容

有鉴于此，本发明针对样本处理、检测及分析过程中目标细胞选取、补偿调节及参数选择的问题，提供了一种流式细胞术检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的方法，旨在建立一种稳定规范的鸡胸腺T淋巴细胞亚群的检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种流式细胞术检测鸡胸腺T淋巴细胞亚群的方法，

包括以下步骤：

步骤1，获取受试鸡胸腺组织并制取单细胞悬液；

步骤2，吸取所述单细胞悬液于两支流式管中，一份细胞液中加入抗鸡的CD3、CD4和CD8单克隆抗体各一头份，旋涡混匀，于4℃避光染色，用作检测管；另一份用作阴性设置管；

步骤3，取染色后的细胞液，用PBS洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；

步骤4，分析检测结果，获得鸡胸腺T淋巴细胞亚群比例。

进一步地，所述制取单细胞悬液具体为：将获取的胸腺组织用机械破碎法获得单细胞，过滤、洗涤后，用预冷的PBS液稀释细胞，获得浓度为1×10⁶-1×10⁷个/mL单细胞悬液，于4℃保存备用。

进一步地，阴性设置管的处理方式有两种，一是用同型对照试剂染色；二是不染色。

进一步地，同型对照试剂的选择方法具体为：选择与抗体对应表面标志的一抗完全相同种属来源、相同亚型及荧光标记的抗体。例如，检测管使用的是小鼠抗鸡的CD4FITC标记的抗体，说明书上显示其成份是Mouse IgG1，那么同型对照就是FITC标记的MouseIgG1。熟悉各单抗阳性细胞的分群情况后，通常使用空白对照来设置阴性对照即可。

进一步地，所述染色的时间为30min。

进一步地，所述洗涤具体是以600-1000r/min的转速离心5分钟。