[发明专利]检测HIV-1 2-LTR DNA的PCR引物组、探针及其试剂盒和检测方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及病毒检测领域，更具体涉及一种检测人类免疫缺陷病毒1型2‑LTR DNA的PCR引物组、探针及其试剂盒和检测方法。本发明提供的检测引物组包括SEQ ID NO：1‑6所示的核苷酸序列；检测探针包括SEQ ID NO：7‑8所示的核苷酸序列。本发明所提供的检测引物组，与传统的实时荧光定量PCR不同，本发明通过引入3对共6条实时荧光定量PCR引物，采用多个循环，并提高引物退火温度，使本发明提供的HIV‑1 2‑LTR DNA PCR检测方法达到极高的灵敏度及特异性，其中最低检出限可达每个PCR中检测2拷贝/百万细胞。同时，本发明还在PCR反应中加入细胞定量反应体系，即可在同一个PCR反应中同时对HIV‑1 2‑LTR DNA及细胞数进行定量(常规方法需要另外对细胞量进行计数)。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及病毒检测领域，更具体涉及一种检测人类免疫缺陷病毒1型2-LTR DNA的PCR引物组、探针及其试剂盒和检测方法。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒(Lentivirus)，属反转录病毒的一种。1983年，人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统失去抵抗力，从而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病。据不完全统计，全球估计有3590至4430万人与人类免疫缺陷病毒相伴生存，其中430至640万人属于新发感染病例，另外，有280至350万人死于艾滋病。

近年来，联合抗逆转录病毒疗法(cART)或者高效抗反转录病毒治疗(HAART)能有效阻断人类免疫缺席病毒(HIV)感染患者体内的病毒复制，使血浆中病毒载量，低于一般检测的检出限。最近有报告的结果表明，一些患者体内的病毒可能会继续复制，但其病毒水平过低无法检测到。同时发现，当治疗中断时会出现血浆病毒载量快速反弹的情况(Butler，S.L.，Hansen，M.S.，and Bushman，F.D.(2001).A quantitative assay for HIV DNAintegration in vivo.Nat Med 7，631-634.)。

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)储存库的持续存在主要是由于HIV-1DNA导致的。在HIV的整个生命周期里，DNA的存在形式包括：线性非整合DNA、环状非整合DNA(1-LTR，2-LTR)、整合的前病毒等。其在细胞核内的含量为：线性非整合DNA＞整合前病毒＞1-LTR＞2-LTR。一般感染HIV-1 3-4h后，可检测到HIV-1 DNA，再过1h，整合DNA开始累积，但仅占总HIV-1 DNA的10％，大约8-12h之后，线性非整合DNA含量达到最高峰，此时环状非整合DNA(1-LTR，2-LTR)可被检测到，1-LTR和2-LTR仅占总HIV-1 DNA的10％和1％(Butler，S.L.，Hansen，M.S.，and Bushman，F.D.(2001).A quantitative assay for HIV DNAintegration in vivo.Nat Med 7，631-634.Kim，S.Y.，Bym，R.，Groopman，J.，andBaltimore，D.(1989).Temporal aspects of DNA and RNA synthesis during humanimmunodeficiency virus infection：evidence for differential gene expression.JVirol63，3708-3713.Vandegraaff，N.，Kumar，R.，Burrell，C.J.，and Li，P(2001).Kinetics of human immunodeficiency virus type 1(HIV)DNA integration inacutely infected cells as determined using a novel assay for detection ofintegrated HIV DNA.J Virol 75，11253-11260.)。