[发明专利]一种酶法合成L-2-氨基丁酸的方法

权利要求书

1.一种酶法合成L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述方法是利用丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶催化2-酮丁酸生产L-2-氨基丁酸；所述丙氨酸脱氢酶选自嗜热脂肪土芽孢杆菌；所述方法具体包括如下步骤：

(1)甲酸脱氢酶(FDH)和丙氨酸脱氢酶(alaD)的异源表达：分别构建FDH和alaD的基因工程菌，经发酵分别制得表达FDH和alaD的菌体——甲酸脱氢酶湿菌体和丙氨酸脱氢酶湿菌体；

(2)然后将2-酮丁酸0.5-1.5mol、甲酸铵0.5-1.5mol、甲酸脱氢酶湿菌体10-30g/L、丙氨酸脱氢酶湿菌体10-30g/L置于反应器中混合均匀，调节pH值为7.0-9.0，温度为30-37℃，催化反应16-20h，得到L-2-氨基丁酸。

2.根据权利要求1所述的酶法合成L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述方法还可以用如下步骤代替：

(1)甲酸脱氢酶FDH和丙氨酸脱氢酶alaD的共表达：构建FDH和alaD的共表达的基因工程菌，经发酵制得共表达FDH和alaD的菌体；

(2)然后将2-酮丁酸0.5-1.5mol、甲酸铵0.5-1.5mol、甲酸脱氢酶和丙氨酸脱氢酶共表达湿菌体15-20g/L置于反应器中混合均匀，调节pH值为7.0-9.0，温度为30-37℃，催化反应16-20h，得到L-2-氨基丁酸。

3.根据权利要求1所述的酶法合成L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述甲酸脱氢酶选自酿酒酵母。

4.根据权利要求1所述的酶法合成L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体如下：

(a)构建alaD载体：

利用BamHI和EcoRI分别将alaD基因和pET32a载体双酶切，然后二者进行连接构建得到重组表达alaD的质粒pET32a-alaD；

(b)构建FDH载体：

利用BamHI和EcoRI分别将FDH基因和pET28a载体双酶切，然后二者进行连接构建得到重组表达FDH的质粒pET28a-FDH；

(c)构建分别表达alaD和FDH的基因工程菌；

将质粒pET32a-alaD和质粒pET28a-FDH分别转入E.coli BL21，得到分别重组表达alaD和FDH的菌株BL21-alaD和BL21-FDH；

(d)将菌株BL21-alaD在发酵培养基中培养，加入0.1-0.5％的乳糖25-30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述alaD表达菌体；

(e)将菌株BL21-FDH在发酵培养基中培养，加入0.1-0.5％的乳糖25-30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述FDH表达菌体。

5.根据权利要求4所述的酶法合成L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基配方为：葡萄糖2％、硫酸铵0.3％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉2％、KH₂PO₄ 1.25％、MgSO₄0.1％、柠檬酸0.15％和乳糖0.1-0.5％，发酵条件：pH7.0，温度37℃，诱导后降温至25-30℃，发酵结束后再以6000rpm转速离心10min，-20℃保存菌体备用。

6.根据权利要求4所述的酶法合成L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述alaD基因的克隆方法为：以嗜热脂肪土芽孢杆菌总DNA为模板，分别以上下游引物进行PCR扩增，从而得到所述alaD基因；

其中,上游引物为5’-aaGGATCCatgaagatcggcattccaaaag-3’，引物中字母大写处为BamHI酶切位点；下游引物为5’-ttGAATTCtcatccctgcagcaacgaatgaac-3’，引物中字母大写处为EcoRI酶切位点。

7.根据权利要求4所述的酶法合成L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述FDH基因的克隆方法为：以酿酒酵母总DNA为模板，分别以上下游引物进行PCR扩增，从而获得所述FDH基因，

其中，上游引物为5’-aaGGATCCatgtcgaagggaaaggttttgc-3’，引物中字母大写处为BamHI酶切位点；下游引物为5’-aaGAATTCttatttcttctgtccataagctc-3’，引物中字母大写处为EcoRI酶切位点。