[发明专利]一种酶法合成L-2-氨基丁酸的方法

说明书

本发明公开了一种酶法合成L‑2‑氨基丁酸的方法，所述方法是利用丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶催化2‑酮丁酸生产L‑2‑氨基丁酸。具体是将2‑酮丁酸0.5‑1.5mol、甲酸铵0.5‑1.5mol、NAD 0‑0.5g/L、甲酸脱氢酶和丙氨酸脱氢酶共表达湿菌体20g/L(或甲酸脱氢酶湿菌体10‑30g/L、丙氨酸脱氢酶湿菌体10‑30g/L)置于反应器中混合均匀，调节pH值为7.0‑9.0，温度为30‑37℃，催化反应16‑20h，得到L‑2‑氨基丁酸。该方法反应速率快，且逆向氧化脱氨活性极低，大大减少了产物的损失。

技术领域

本发明属于领域化学合成技术领域，具体涉及一种酶法合成L-2-氨基丁酸的方法。

背景技术

L-2-氨基丁酸是生产新型抗癫痫药左乙拉西坦的关键中间体，也是合成抑菌抗结核药乙胺丁醇的关键手性前体，是多种手性药物的重要手性中间体。近年来，L-2-氨基丁酸的合成技术成为了基因工程制药的研究热点。很多研究利用FDH构建NADH再生体系，并与亮氨酸脱氢酶共表达，通过构建双酶偶联的催化系统，以2-酮丁酸为底物生成L-2-氨基丁酸，解决了NADH价格昂贵的问题，很大程度上节省了成本。

但是目前合成L-2-氨基丁酸的方法一般成本较高，或者转化率较低，比如申请号为20101014469206的发明专利公开了一种酶法制备L-2-氨基丁酸的方法，其采用的是L-苏氨酸为起始原料，首先通过苏氨酸脱氨酶使其反应转化为L-2酮酸，然后使用亮氨酸脱氢酶使L-2酮酸反应转化为L-2-氨基丁酸，并且反应中加入了用于辅酶再生的甲酸脱氢酶。此方法采用的是“一锅煮”的形式，这种方式虽然操作相对来说比较简单，但是反应中存在未反应物或者反应不彻底，转化率低的问题，因此，需要一种新的方法来解决这个问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的酶法合成L-2-氨基丁酸的方法，用以解决现有技术中转化率低的问题。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

本发明以2-酮丁酸为底物，通过丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶催化生产L-2-氨基丁酸。

具体技术方案如下：以甲酸脱氢酶催化甲酸铵产生过量的NH3，然后2-酮丁酸和NH3在丙氨酸脱氢酶的催化下被还原成L-2-氨基丁酸。其中丙氨酸脱氢酶的还原活性需要辅酶NADH，甲酸脱氢酶的氧化活性需要NAD+，由此形成循环的辅酶再生系统，解决了NADH价格昂贵的问题。

优选地，所述丙氨酸脱氢酶来自于嗜热脂肪土芽孢杆菌，但不局限于此菌，该菌中所含的丙氨酸脱氢酶对氨基丁酸的低亲和力成为其催化2-酮丁酸的一大优势。

本发明中的甲酸脱氢酶来自于酿酒酵母，但不局限于酿酒酵母，用于辅酶NADH的再生。

本发明中一种优选的实施方式，将丙氨酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因分别克隆至表达载体，导入到大肠杆菌，实现基因的表达，然后收集表达丙氨酸脱氢酶的细胞和表达甲酸脱氢酶的细胞，菌体放入-80℃保存24h，菌体融化后直接添加于催化体系中催化生产L-2-氨基丁酸。具体地，所述方法如下：

(1)甲酸脱氢酶FDH和丙氨酸脱氢酶alaD的异源表达：分别构建FDH和alaD的基因工程菌，经发酵分别制得表达FDH和alaD的菌体——甲酸脱氢酶湿菌体和丙氨酸脱氢酶湿菌体；

(2)然后将2-酮丁酸0.5-1.5mol、甲酸铵0.5-1.5mol、甲酸脱氢酶湿菌体10-30g/L、丙氨酸脱氢酶湿菌体10-30g/L置于反应器中混合均匀，调节pH值为7.0-9.0，温度为30-37℃，催化反应16-20h，得到L-2-氨基丁酸。

其中步骤(1)的具体方法如下：

(a)构建alaD载体：