[发明专利]一种检测包含潜伏期结核感染的试剂盒及其引物对和探针

说明书

技术领域

本发明涉及一种结核感染的试剂盒，尤其涉及采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术来检测包含潜伏期在内的全程结核感染的试剂盒及其引物对和探针。

背景技术

从全球范围来看，结核至今为止仍然是传染病中发病率和死亡率最高的疾病之一，据估计每年新发病例约900，0000人，每年约有200，0000人死于结核病。结核病是由结核杆菌引起的一种人畜共患传染病，是单一致病菌感染导致死亡率最高的感染性疾病。我国是结核病高负担国家之一，2000年全国结核病流行病学抽样调查资料显示：全年龄组结核感染率为44.5％，活动性结核患者451万，每年死亡人数达13万，结核病死亡占各种传染病，寄生虫病死亡的65.1％，几乎为其它各种传染病、寄生虫病死亡总和的2倍。由于人类免疫缺陷病毒的广泛传播及耐药结核分枝杆菌的日益增多，使得这一古老的疾病再次引起人们的广泛关注。结核病成为危害人类健康的重要传染病之一。

由于诊断潜伏性结核感染的检测方法研究进展缓慢，导致结核疫情控制不佳。目前，全血γ-干扰素释放试验(IGRA)已经在欧美地区和日本等多个低结核疫情国家广泛使用，IGRA采用起源于卡介苗接种菌及大多数非结核分枝杆菌所缺失的结核菌致病菌中的RD1-区所编码的特异性刺激蛋白如ESAT-6和CFP-10来进行检测，该类刺激物已经有商品化IGRA试剂，例如QuantiFERON TB Gold test和T SPOT.TB test。有研究者在IGRA检测中量化干扰素-γ(IFN-γ)mRNA表达水平，将其作为IFN-γ指示物，但IFN-γRT-PCR的特异性和灵敏度较差，且无法鉴别活跃期和潜伏期结核感染(LTBI)。

在中国，TST作为一种基于对结核菌衍生的纯化蛋白(PPD)所产生的迟发型变态反应的检测方法仍然是用来诊断结核菌潜伏性感染(LTBI)的主要方法。TST的敏感度和特异度都依赖于一个特定群体中所定义的不同截断值而定。如果提高反应硬结直径截断值特异度就会增加(同时敏感度下降)。该实验的特异度变化很大而且主要依赖与非结核分支杆菌之间的交叉反应的可能性而定。另外，TST不能区分陈旧感染与新近感染，与卡介苗及环境非结核分支杆菌之间存在交叉免疫而导致假阳性，更由于在免疫抑制人群中检测结果存在假阴性甚至可能导致误诊。重复TST反应或者两步法TST检测可能导致助推效应从而引起敏感度的增加。

TST和IGRAs均不能鉴别潜伏期和活动期结核，而根除结核的关键之一在于鉴别潜伏性结核感染。因此，探索一种特异性强、灵敏度高的诊断潜伏性结核感染的检测方法至关重要。

实时荧光定量PCR(FQ-PCR)是近年在普通PCR基础上发展起来的核酸检测方法，它将荧光值的积累与PCR产物的扩增过程相结合，通过测量指数扩增期的荧光值来计算待测样本中核酸的原始量。其具有操作简便、耗时短、可定量等传统方法无可比拟的优点。另外，趋化因子是一类结构功能相似，具有趋化吸引性的小分子量蛋白，其一级结构十分相似，当趋化因子与其相应受体相结合后，通过激活G蛋白偶联受体，产生级联信号传导，对多种炎性细胞趋化和激活，在呼吸系统、心血管和肝肾等疾病中起重要作用。比如，由活化的淋巴细胞分泌的下游趋化因子γ-干扰素在结核感染检测中敏感度达80％。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中存在的针对结核感染的检测方法不能鉴别潜伏性结核感染以及现有检测方法特异性或敏感度不强等缺陷，提供一种检测包含潜伏期在内的全病程结核感染的试剂盒、特别是荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)试剂盒及其引物对和探针。该试剂盒具有操作简便、特异性强、灵敏度高、耗时短以及可定量等优点，特别能够检测潜伏期和/或早期的结核感染。