[发明专利]核酸和重组质粒及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及蛋白表达和纯化领域，公开了一种核酸和重组质粒及其制备方法和应用。所述核酸能够编码骨形态发生蛋白BMP‑2成熟肽，其中，所述核酸为SEQ ID NO：1所示的核酸，或者在SEQ ID NO：1的5’末端和/或3’末端连接有标签的核酸序列所示的核酸。采用本发明的质粒和蛋白表达纯化方法，通过采用优化密码子以及特定的表达菌株，配合特定的表达和纯化蛋白的条件，获得了高产量的骨形态发生蛋白BMP‑2成熟肽，并且所得蛋白活性好。

技术领域

本发明涉及蛋白表达与纯化领域，具体涉及一种核酸，一种重组质粒，一种重组质粒的制备方法，一种重组菌株、一种制备骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的方法以及相关的应用。

背景技术

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)属于转化生长因子(TGF-β)超家族成员，由骨基质分泌的一种疏水性蛋白。成熟肽中含有7个高度保守的半胱氨酸，它们形成三个链内二硫键及一个链间二硫键并将两条多肽链连接为二聚体，BMP家族包括BMP-1、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-12和BMP-14等，其中BMP-2具有明显诱导未分化的成纤维细胞走向分化为成骨细胞的作用并能调节成骨细胞和成软骨细胞的分化，诱导异位骨形成和促进骨折愈合的功能。BMP-2蛋白在骨科领域中治疗新鲜骨折、骨缺损、骨不连、脊柱融合、股骨头缺血性坏死，骨形态发生蛋白与基因治疗等方面具有应用前景。目前纯化的人和牛的BMP-2已经用于临床。它具有募集间充质干细胞、趋化、促进血管生成及加速骨的愈合修复，但BMP-2靠天然纯化提取的量极少，难以满足临床需求。

CN101235084A公开了一种rhBMP-2(骨形态发生蛋白BMP-2)成熟肽在原核生物中表达方法：删除DsbA基因信号肽第2-18个氨基酸编码基因，保留第一个甲硫氨酸的密码子作为起始密码子，得到的片段重组于表达载体中，获得重组质粒1；将骨形态发生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA重组于重组质粒1中DsbA基因的下游，获得重组质粒2：将重组质粒2转化入表达宿主菌株的菌体中，得到工程菌。经培养、添加诱导剂使目的基因表达，破菌、分离纯化得到DsbABMP-2融合蛋白，蛋白酶酶切DsbA-BMP-2融合蛋白，经分离得到所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽。但是该专利申请的方法较复杂，rhBMP-2成熟肽的产量和纯度(或活性)仍有待提高。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽制备方法复杂、产量低的缺陷，提供了一种核酸、重组质粒及其制备方法、重组菌株、制备骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的方法和相关的应用。采用本发明的方法，操作过程相对简单，表达骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽产量高，并能保持蛋白活性。

具体地，第一方面，本发明提供了一种核酸，该核酸能够编码骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽，其中，所述核酸为SEQ ID NO：1所示的核酸，或者在SEQ ID NO：1的5’末端和/或3’末端连接有标签的核酸序列所示的核酸。

第二方面，本发明提供了一种重组质粒，该重组质粒含有上述本发明提供的核酸。

第三方面，本发明提供了一种重组质粒的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)提供或制备具有SEQ ID NO：3所示序列的核酸序列；

(2)将具有SEQ ID NO：3所示序列的核酸序列和pET30a(+)载体分别使用KpnI和XhoI内切酶进行酶切，并将酶切后的产物连接。

第四方面，本发明提供了一种重组菌株，所述重组菌株含有上述本发明提供的重组质粒。

第五方面，本发明提供了一种制备骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的方法，该方法包括：

第六方面，本发明提供了上述核酸、重组质粒或重组菌株在制备用于促进骨再生和/或骨修复的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽或药物中的应用。