[发明专利]一种利用胶体金免疫层析试纸条检测乳中TEM型β‑内酰胺酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用胶体金免疫层析试纸条检测乳中TEM型β-内酰胺酶的方法，属于食 品检测技术领域。

背景技术

当前，牛奶中抗生素超标已成为影响牛奶食用安全的一个因素，一些不法商贩将β-内酰 胺酶加入牛奶中，β-内酰胺酶能水解β-内酰胺类抗生素的结构活性中心-内酰胺环使其失去活 性，掩盖其抗生素超标的事实，这可能会使消费者对抗生素类药物耐药性增高，并且其水解 产物青霉噻唑酸会使有过敏体制的人出现不适反应。目前在我国易滥用的食品添加剂品种和 违法添加的非食品用物质名单中就有β-内酰胺酶。

β-内酰胺酶分为4种(A-D类)，TEM型β-内酰胺酶是最早被发现的一种β-内酰胺酶，属于 A类β-内酰胺酶，并且已经成为肠杆菌科中发现的最常见的β-内酰胺酶，能够有效地水解青霉 素。

为了提高我国乳制品的竞争力，加强乳制品安全性检测，有必要建立快速有效的方法来 检测乳制品中的β-内酰胺酶。乳中β-内酰胺酶的检测方法已有较多的研究，但这些方法的使 用均有一定的局限性。微生物法灵敏度高，但检测时间长，操作技术要求高；碘量法的重现 性不好；酸定量法易受环境温度影响；高效液相色谱的样品前处理复杂且成本较高；头孢噻 唑酚显色法成本也较高。

胶体金现已广泛用于农业、食品等领域，例如用作免疫分析系统的标识物，应用于制备 免疫层析试纸条。免疫层析试纸条检测因为其敏感性、快速性等优势而适用于进行现场检测 的筛选工具。在快速检测方面，张立静等制备单克隆抗体和多克隆抗体，采用双抗夹心法制 备了胶体金免疫层析试纸条。因为考虑到单克隆抗体的特异性较高，所以本文主要选取成对 的单克隆抗体，采用双抗夹心法制备胶体金免疫层析试纸条用于检测TEM型β-内酰胺酶，为 不同种类乳制品中β-内酰胺酶的检测方法的建立提供参考依据。

发明内容

为完善现有的技术，本发明提供了一种利用胶体金免疫层析试纸条检测乳中TEM型β- 内酰胺酶的方法，用于检测牛奶中β-内酰胺酶，本课题利用免疫胶体金分析法制备胶体金免 疫层析试纸条，优化试纸条的制备过程，确定试纸条的灵敏度。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明制备了β-内酰胺酶胶体金免疫层析试纸条，用于检测牛奶中的β-内酰胺酶。采用 Frens方法制备胶体金，利用目测法、紫外扫描、透射电镜鉴定胶体金颗粒的大小、均匀度、 分散性。通过Mey氏稳定化实验确定能使胶体金溶液稳定的最适抗体浓度及最适pH值，确 定好后进行低温高速离心制备金标抗体，利用目测法、可见光分光光度法、斑点金免疫渗滤 试验鉴定金标抗体标记效果及是否具备活性，优化金标抗体的制备过程。确定检测线和质控 线上一抗二抗的稀释倍数，在NC膜上划线检测。选择四种常见的NC膜进行性能测试，金 标垫、吸水纸、PVC板和样品垫做统一选择。

组装试纸条，用划膜仪在试纸条NC膜上进行划线，划线量为1μL/cm，T/C线距离5mm， 划线后烘干处理，切成3mm宽的试纸条。样品检测时，复溶的金标抗体与样品反应3min制 备成混合物，再用试纸条插入混合物中，检测试纸条的灵敏度检测及稳定性，确定最低检测 限及保存时间。

附图说明

图1胶体金透射电镜图

图2最适标记pH值的确定

图3最适标记抗体添加量的确定

图4紫外扫描图

图5β-内酰胺酶试纸条的灵敏度(IU/mL)

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技 术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明 的保护范围中。

一、胶体金的制备及鉴定

目测制得的胶体金颜色呈酒红色，透明无沉淀，质量较好。从紫外扫描图图4可知，最 大吸收峰峰值为523nm，根据最大吸收波长和粒径之间的公式Y＝0.4271X+514.56(X： λmax,Y：纳米金平均粒径)，计算出平均直径为20nm。如图1为透射电镜下(200nm)观察到 的胶体金颗粒，大小基本一致,且分散性比较好，没有聚集现象，最终测得胶体金颗粒平均直 径约为20.6nm，与紫外测得结果基本一致。

二、金标抗体的制备与纯化