[发明专利]一种烟草黑胫病菌发酵液致病活性成分及其制备方法

说明书

本发明涉及一种烟草黑胫病菌发酵液致病活性组分及其制备方法。包括以下步骤：(1)黑胫病菌菌丝在液体培养基中摇床振荡培养；收集无菌发酵液，离心，将上清液过滤除菌，待用；(2)将步骤(1)得到的除菌后的黑胫病菌无菌发酵液通过微滤中空纤维素膜和超滤中空纤维素膜进行膜过滤分离，得到澄清透明的超滤液；将超滤液上柱进行大孔吸附树脂富集后用乙醇将树脂上吸附的成分冲下，得到乙醇脱洗液，即黑胫病菌发酵液致病活性组分。本发明操作简单、结果可靠、黑胫病菌发酵液致病活性组分的致病能力强，稳定性好，能够高效用于烟草黑胫病菌抗性品种的筛选。

技术领域

本发明属于病理学领域，特别涉及一种烟草黑胫病菌发酵液致病活性成分及其制备方法。

背景技术

烟草黑胫病最早在印度尼西亚的瓜哇被发现。1950年首次报道该病发生于我国黄淮烟区，并长时间为害且病情越来越严重。目前烟草黑胫病除东北烟区零星发病外，全国其他烟区均普遍发生，每年造成的经济损失严重，仅次于病毒病。

当前，防治烟草黑胫病的常用化学药剂主要有瑞毒霉(甲霜灵)可湿性粉剂、波尔多液、甲基托布津、敌克松可湿性粉剂、杀毒矾M-8可湿性粉等，期间多种药剂可联合施用，分时分期喷洒，具有理想的防病增产作用。此外，寻找新的防治方法以克服烟叶农药残留和病菌抗药性的问题，生物防治的多样性决定了防治方法的多样性，也保证了烟草黑胫病的生物防治途径的多样性。国外有研究表明：在烟草黑胫病的防治工作中，木霉菌拮抗效果突出，主要缘于木霉菌在土壤中占据了侵染点位后，与黑胫病菌产生竞争，进而降低烟草黑胫病菌的侵染几率。

随着烟草行业不断向绿色无公害方向发展，对烟草黑胫病的防治仅仅停留在合理轮作为主、起垄栽培和化学防治为辅的综合防治措施已不能满足发展的需求。生物防治中寻找拮抗烟草黑胫病的菌株虽然也能在一定程度上有效防治烟草黑胫病菌，但只有烟草品种的抗病性本身才是防治病害的基础，因而对抗性品种的研究是当今烟草领域的一个热门话题。

发明内容

本发明的目的是提供一种烟草黑胫病菌发酵液致病活性组分及其制备方法。本发明的制备方法操作简单、结果可靠、致病能力强，稳定性好，能够高效用于烟草黑胫病菌抗性品种的筛选。

一种烟草黑胫病菌发酵液致病活性组分的制备方法，步骤包括：

(1)黑胫病菌菌丝在液体培养基中摇床振荡培养；收集无菌发酵液，离心，将上清液过滤除菌，待用；

(2)将步骤(1)得到的除菌后的黑胫病菌无菌发酵液通过微滤中空纤维素膜和超滤中空纤维素膜进行膜过滤分离，得到澄清透明的超滤液；将超滤液上柱进行大孔吸附树脂富集后用80-95％的乙醇将树脂上吸附的成分冲下，得到80-95％乙醇洗脱液，即黑胫病菌发酵液致病活性组分。

作为进一步的改进，步骤(1)所述的液体培养基为马铃薯液体培养基。

作为进一步的改进，步骤(1)中的摇床培养条件：26-30℃、180-250rpm，优选28℃,220rpm。

作为进一步的改进，步骤(1)中从培养后的第5d-7d收集无菌发酵液，优选第7d。

作为进一步的改进，步骤(1)中4℃、6000-10000rpm离心10-20min，优选8000rpm离心15min；将上清液经0.22um细菌过滤器过滤除菌，保存于4℃冰箱中待用。

作为进一步的改进，步骤(2)中采用的是5KDa微滤中空纤维素膜和3KDa超滤中空纤维素膜进行膜过滤分离。

作为进一步的改进，步骤(2)中采用的是D101型大孔吸附树脂。

作为进一步的改进，步骤(2)中采用的乙醇浓度是95％。

一种烟草黑胫病菌发酵液致病活性组分，是由上述的方法制备而成的。