[发明专利]新的赖氨酸脱羧酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了新的赖氨酸脱羧酶，其氨基酸序列由SEQ ID NO:1所示序列突变而来，在选自下组的一个或多个氨基酸残基位点发生突变：9位、44位、88位、111位、176位和230位。本发明的赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸产生1,5‑戊二胺的活性显著提高，从而可以降低催化剂的用量最终降低生产成本。本发明还提供了包含所述赖氨酸脱羧酶的编码序列的表达载体、包含能够表达所述赖氨酸脱羧酶的宿主细胞以及它们在产生1,5‑戊二胺中的用途和生产方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及具有高活性的赖氨酸脱羧酶、包含该赖氨酸脱羧酶编码基因的表达载体和能够表达该赖氨酸脱羧酶的基因工程菌，以及所述赖氨酸脱羧酶、表达载体和基因工程菌在生产1,5-戊二胺中的应用。

背景技术

1,5-戊二胺，又名尸胺、1,5-二氨基戊烷、五亚甲基二胺和尸毒素，是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱，是赖氨酸在赖氨酸脱羧酶(E.C.4.1.1.18)的作用下脱羧产生的，反应为L-lysine+H⁺→CO₂+cadaverine。

1,5-戊二胺具有各种各样的功能及用途。例如，在农业上，1,5-戊二胺可用于调控植物衰老过程、促进雌雄蕊的发育、改善植物果实发育、提高果实产量。在医学上，它可作为一种有效治疗痢疾的药物，也是一种重要的药物中间体。在工业上，1,5-戊二胺是一种重要的化工原料；将1,5-戊二胺与二元酸进行聚合反应可合成优质高分子材料-新型尼龙，1,5-戊二胺基不依赖于石油原料的生物制造工艺可能对尼龙工业产生颠覆性的影响。

尼龙66是由己二胺和己二酸1:1聚合生成，与尼龙6同为尼龙两大品种之一。目前，己二胺或其合成前体己二腈国内主要依赖进口。1,5-戊二胺与己二胺互为同系物，在结构上与己二胺非常相似，可以替代己二胺，和二元酸共聚合成具有实用性的尼龙5X(4、6、10等)。尼龙56性能媲美经典的尼龙66，而吸湿排干率、透气性、柔软度等性能更佳，可广泛应用作纤维(服装、轮胎、地毯等)和工程塑料(电子产品、汽车部件等)。尼龙54和尼龙510等其它以1,5-戊二胺为单体制成的尼龙产品具有特殊的材料性能，具有潜在的应用价值。

赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧形成1,5-戊二胺，是1,5-戊二胺合成途径中的关键酶。赖氨酸脱羧酶存在于各种微生物中。目前，已经分别从大肠杆菌(E.coli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、反刍动物月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)等细菌中克隆出赖氨酸脱羧酶基因。

最新的研究普遍采用过表达大肠杆菌的CadA来生产1,5-戊二胺。日本味之素公司的US7189543专利中保护了以二羧酸调节pH并通过细胞过表达大肠杆菌的野生型CadA酶转化赖氨酸产生1,5-戊二胺，产量达69g/L。上海凯赛在其专利CN102851307A中通过在蜂房哈夫尼菌中过量表达大肠杆菌野生型CadA酶来转化赖氨酸，从而实现戊二胺和下游聚合物的制备。日本味之素公司的EP3118312专利中公开了热稳定性提高的大肠杆菌CadA突变位点Val3、Ala590和Glu690。日本三井化学公司的US2015132808专利保护了多个活性增加的大肠杆菌CadA突变体，然而，这些CadA突变体的活性提高程度均低于20％，甚至大多数CadA突变体的活性提高程度不到10％，因此这些CadA突变体在实际生产上的应用价值非常有限。

赖氨酸脱羧酶作为催化赖氨酸生产1,5-戊二胺的催化剂，提升赖氨酸脱羧酶的活性可以减少催化剂的用量或缩短反应时间，进而降低生产成本，对1,5-戊二胺的工业化有重要的影响，因此本领域急需提升赖氨酸脱羧酶的性能，实现1,5-戊二胺的工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种性能提升的赖氨酸脱羧酶，以便实现1,5-戊二胺的工业化生产。