[发明专利]一个早期评估食管癌发病风险的SNP及检测试剂盒

说明书

本发明是一个与食管鳞癌发生高度相关的单核苷酸多态性位点的检测试剂盒。该试剂盒包括针对5‑脂氧合酶E254K位点设计的上游等位基因特异性引物2条，下游引物1条，一对内参照引物，PCR mix，灭菌水。本发明所采用的试剂盒能够快速检测出与食管鳞癌发生高度相关的5‑LO E254K位点，与经典的测序法和酶切法相比具有简便、经济、快速等特点，并且本发明所基于的等位基因特异性PCR法是一种成熟可靠、可在基层医院广泛使用的方法。

技术领域

本发明涉及人外周血基因组DNA并利用等位基因特异性PCR法去检测食管癌患者的5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LO)c.760G＞A(E254K)位点情况进而早期评估食管癌发病风险的试剂盒。

背景技术

食道鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC)是我国一种常见的上消化道恶性肿瘤，在国人的恶性肿瘤死亡率中位居第四位。上世纪70年代，在全国范围内实施了恶性肿瘤普查，确立河北磁县、河南林县、山西阳泉、四川盐亭、广东潮汕和江苏淮安等地区为中国食管癌六大高发区。内蒙赤峰地区是我国北方食管癌较高发地区。我们的前期流行病学调查结果表明，该地区食管癌发病具有鲜明的蒙古族高发的特点。尤其是蒙古族牧民集中居住的牧区，食管癌的发病率最高，是危害当地蒙古族牧民的最主要恶性肿瘤，男性发病率远远高于女性。值得特别注意的是，赤峰地区蒙古族人发生食管癌有明显家族聚集性，比如我们初步的调查结果显示，在赤峰翁牛特旗一个牧场的200多户蒙古族居民中，近十年来发现有20余人患食管癌，情况十分严重，其中一个典型的例子是一家兄弟三人均因罹患食管癌死亡。

早期评估食管癌发病风险对于临床早期诊断和预防具有重要意义。一些食管癌若早期发现是可以完全治愈的，因此，食管癌重在早期诊断。然而，目前除了做X线钡餐检查和胃镜外还没有一种简便无创的方法可以早期评估食管癌发病风险。做胃镜对患者来说比较痛苦，是一种有创性的检测手段，很多患者因为害怕做胃镜而错失早期诊断的机会。对于临床症状尚不明显的食管癌早期评估来说，需要一种快速简便且无创的检测方法来评估食管癌的发病风险，本发明所采用的试剂盒能够快速检测出与食管鳞癌高度相关的5-LO E254K位点，与经典的测序法和酶切法相比具有简便、经济、快速等特点，与胃镜法相比对人体无伤害，属于无创性的早期检测方法，并且本发明所基于的等位基因特异性PCR法是一种成熟可靠、可在基层医院广泛使用的方法。本试剂盒中5-脂氧合酶的背景介绍如下。

花生四烯酸和白三烯等脂类物质代谢异常在食管癌的发生发展中发挥着十分重要的促进作用，而5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LO)是机体催化花生四烯酸生成生物活性分子从而影响细胞信号传导及代谢的关键酶。

人类的5-LO基因定位于第10号染色体p11.2亚带，长度超过82kb，包括14个外显子和13个内含子，5-LO蛋白包含674个氨基酸，编码蛋白的分子量约为72～80KD。其cDNA760位的G突变成A，760G＞A位于第六个外显子中，在基因库中也有记载，其对应的254位的氨基酸由带负电荷的谷氨酸(E)突变成带正电荷的赖氨酸(K)，这一单核苷酸多态性(SNP)引起了电荷的改变对酶的功能或者该酶与其他酶之间的相互作用都有可能受影响。有研究证明我国人群中5-脂氧合酶基因E254K多态性与哮喘的发生有关，与食管癌的发生是否有关尚不清楚。该研究的目的在于检测该多态性在食管癌患者中的分布情况，同时与正常人群中的分布情况进行对比，进而揭示该多态性与食管癌发生的关系。

该研究证实，5-LO cDNA第760位的碱基G突变成碱基A，使相应的254位氨基酸由谷氨酸Glu(E)变成了赖氨酸Lys(K)。该突变与食管癌的发生高度相关，该结果为家族性食管癌发生提供了一个新的机制。