[发明专利]水稻TMS10基因的定点敲除系统及其应用

权利要求书

1.一种水稻雄性不育基因TMS10的定点敲除系统，其特征在于，所述定点敲除系统包括CRISPR/Cas9系统，以及sgRNA靶点；所述sgRNA靶点为水稻雄性不育基因TMS10中含有PAM或NGG的序列。

2.根据权利要求1所述的定点敲除系统，其特征在于，所述定点敲除系统由CC-TMS10-1组成；

所述CC-TMS10-1为特异性修饰水稻雄性不育基因TMS10内靶序列的CH-CRISPR/Cas9系统；所述靶序列为位于SEQ ID NO.1所示序列的第2281位至第2299位的核酸序列；所述靶序列的长度为19bp。

3.根据权利要求2所述的定点敲除系统，其特征在于，所述CC-TMS10-1由SEQ IDNO.1所示序列的第2281位至第2299位所示核苷酸序列组成。

4.一种含有如权利要求1～3中任一项所述的定点敲除系统的编码基因的表达盒、重组菌或重组细胞系。

5.一种含有如权利要求1～3中任一项所述的定点敲除系统的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为重组表达载体CC-TMS10-1；

所述重组表达载体CC-TMS10-1为在载体pCAMBI1300的CAMV35S启动子下游插入CC-TMS10-1入门载体；

所述CC-TMS10-1入门载体是将载体18T-Cas9-chimeric-Os中BbsI位点间的片段替换为所述靶序列的重组载体。

6.一种水稻温敏雄性不育基因TMS10定点敲除的不育株系创制方法，其特征在于，所述方法包括：

常规水稻品种选择：在水稻中筛选如权利要求1～3中任一项所述的定点敲除系统在所述水稻品种中表达的步骤；

CC-TMS10-1在水稻的表达，转化植株筛选，突变植株鉴定，即得所述水稻温敏雄性不育基因TMS10定点敲除的不育株系。

7.根据权利要求6所述的不育株系创制方法，其特征在于，所述水稻品种包括粳稻品种、籼稻品种；所述粳稻品种包括9522、N6B、KY131；所述籼稻品种包括明辉63、珍汕97。

8.根据权利要求6所述的不育株系创制方法，其特征在于，所述CC-TMS10-1在水稻的表达是通过重组表达载体CC-TMS10-1将编码所述CC-TMS10-1的靶序列导入所述水稻中实现的。

9.根据权利要求6所述的不育株系创制方法，其特征在于，所述转化植株筛选是通过CRISPR/Cas9系统载体的通用引物M13F和CC-TMS10-1靶序列R引物的聚合酶链式反应扩增实现的；所述通用引物M13F的序列如SEQ ID NO.6所示，所述CC-TMS10-1靶序列R引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

10.根据权利要求6所述的不育株系创制方法，其特征在于，所述突变植株鉴定是通过TMS10基因的特异性引物扩增TMS10基因的基因组片段，然后进行测序及与TMS10野生型序列比对实现的；所述特异性引物为如SEQ ID NO.4所示的TMS10-F和如SEQ ID NO.5所示的TMS10-R。

11.根据权利要求6～10中任一项所述的不育株系创制方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9技术使水稻品种中如SEQ ID NO.1所示序列第2281位至第2299位发生插入或缺失，进而获得水稻雄性不育株系。

12.根据权利要求1～3中任一项所述的定点敲除系统及权利要求8～11中所述方法在创制水稻雄性不育株系中的应用。