[发明专利]水稻TMS10基因的定点敲除系统及其应用

说明书

技术领域

本发明属于水稻育种技术领域，具体涉及一种水稻雄性不育基因TMS10的定点敲除系统及其在不同水稻品种中的应用。

背景技术

雄性不育系为水稻杂交制种技术提供关键的育种材料，在全世界范围内展开广泛的研究。水稻温敏雄性不育(Thermo-sensitive genic Male Sterile，TMS10)基因编码一个参与水稻花药发育的亮氨酸富集重复序列的受体激酶(LRR-RLK)，主要在花药发育早期表达。TMS10基因的突变会造成水稻温敏雄性不育，表现出在平均温度高温下雄性不育、平均温度低温条件下恢复可育的特征；此外，TMS10不育系和恢复系JP69杂交产生的F1代具有杂种优势，因此，基于TMS10的温敏雄性不育系，可用于水稻两系杂交稻制种，应用前景广阔。

CRISPR/Cas9(成簇、规律间隔短回文重复序列及相关蛋白)系统是近几年出现的基因组编辑新技术，在各种生物和细胞等领域都有广泛的研究和应用。CRISPR/Cas9系统是一种源于原核生物抵御噬菌体、质粒等入侵长期进化的获得性免疫系统，其在指导RNA下完成对外源遗传物质的降解。CRISPR/Cas9系统的Cas9蛋白与sgRNA形成复合体，切割与sgRNA上的spacer互补的基因组DNA序列，产生DNA双链断裂(DSB)，激活细胞启动DNA损伤修复机制，通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)方式引入突变。与锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)相比，CRISPR/Cas9系统技术具有设计简单、构建快速、突变效率高、多靶点同时编辑等优势。

目前，水稻雄性不育系的创制主要是通过持续杂交和回交的方式将不育基因或位点导入其他水稻品种中，但是转育周期较长、过程较复杂、劳动成本大。本发明通过CRISPR/Cas9系统的靶向修饰直接对水稻TMS10基因进行定点突变或敲除，创制基于TMS10基因的水稻温敏雄性不育株系，将大大缩短育种周期。

发明内容

本发明的目的在于克服现有水稻雄性不育系的创制存在的转育周期较长、过程较复杂、劳动成本大等缺陷，提供一种水稻TMS10基因的定点敲除系统及其应用；具体涉及一种水稻雄性不育基因TMS10的定点敲除系统及其在水稻品种粳稻品种9522、农6B、空育131；籼稻品种明辉63、珍汕97中定点敲除应用的方法，利用TMS10基因及其蛋白参与水稻花药发育调控的特点及CRISPR/Cas9系统的基因组靶向修饰，通过突变该基因核苷酸序列筛选水稻雄性不育株系，在农业生产上具有十分重要的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种水稻雄性不育基因TMS10的定点敲除系统；所述定点敲除系统包括CRISPR/Cas9系统，以及sgRNA靶点；所述sgRNA靶点为水稻雄性不育基因TMS10中含有PAM或NGG的序列。

备注：其基本的原理是由CRISPR/Cas9系统，形成重组载体，将重组载体转入水稻中，重组载体与sgRNA位点结合，造成对应翻译形成的DNA断裂，进而实现突变。

优选的，所述水稻雄性不育基因TMS10的定点敲除系统由CC-TMS10-1组成；

所述CC-TMS10-1为特异性修饰所述水稻雄性不育基因TMS10内靶序列的CH-CRISPR/Cas9系统；所述靶序列为位于SEQ ID NO.1所示序列的第2281位至第2299位的核酸序列；所述靶点序列长度为19bp。单独使用所述CC-TMS10-1可在所述水稻基因TMS10内靶序列处引入插入缺失突变，使所述水稻TMS10基因失去原有的功能；

在上述定点敲除系统中，所述CC-TMS10-1由SEQ ID NO.1所示序列的第2281位至第2299位所示核苷酸序列组成。

在上述定点敲除系统中，所述水稻TMS10基因为SEQ ID NO.1序列所示基因。

本发明保护含有上述所述定点敲除系统的编码基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或重组细胞系。

所述重组表达载体为重组表达载体CC-TMS10-1；

所述重组表达载体CC-TMS10-1为在载体pCAMBI1300的CAMV35S启动子下游插入CC-TMS10-1入门载体；所述CC-TMS10-1入门载体是将载体18T-Cas9-chimeric-Os中BbsI位点间的片段替换为所述靶序列的重组载体。所述CC-TMS10-1靶序列具体为SEQ ID NO.1所示序列的第2281位至第2299位的核酸序列。