[发明专利]一种非损伤检测脑片神经元钙离子跨膜流动的方法

权利要求书

1.一种非损伤检测脑片神经元钙离子跨膜流动的方法，它包括测试电极（1）与参比电极（2），所述测试电极（1）中测试电极丝（11）的材质为AgCl丝，参比电极（2）材质为Ag/AgCl固态电极，其特征在于按以下步骤依次进行：

a、测试电极的设置：

测试电极（1）还包括锥形管（12），首先，向锥形管（12）尖嘴部填充Ca²⁺液态离子交换剂；其次，再向锥形管（12）中添加Ca²⁺电解质溶液；最后，将测试电极丝（11）从锥形管（12）圆口端插入锥形管（12）内并与电解质溶液接触，形成测试电极（1）；

b、测试电极（1）与参比电极（2）位置的设置：

在培养皿上方设置电极固定架，所述参比电极（2）固定设置于电极固定架的一端，参比电极（2）下端部延伸至培养皿内部并可以与脑片营养液接触；测试电极（1）设置于电极固定架的另一端，测试电极（1）与驱动装置连接，驱动装置精确驱动测试电极（1）产生位移；测试电极与参比电极之间通过电位测试装置连接；

c、电压/浓度校正曲线的获得：为保证测试电极（1）正常工作，在待测范围内以10为倍数改变浓度作为常规背景浓度，采用含有3毫摩尔Ca²⁺的人工脑脊液作为测试电极的校正液A，含有0.3毫摩尔Ca²⁺的人工脑脊液作为校正液B，分别将测试电极（1）和参比电极（2）一起放入校正液A或者校正液B中，分别获得校正液A中的电极电位值和校正液B中的电极电位值，通过Nernst方程获取电压/浓度校正曲线；

d、Ca²⁺跨膜运动的观测及Ca²⁺流动速率的确定：首先，在培养皿中分别添加含淀粉样蛋白的正常Ca²⁺浓度的人工脑脊液或者低Ca²⁺浓度的人工脑脊液作为测试液；其次，取脑片置于培养皿中；再次，将参比电极（2）放入测试液中，并将测试电极（1）移动至脑片的近端位置，通过驱动装置驱动测试电极移动至脑片的远端位置，获得位移差dx，同时采集近端位置与远端位置电极电位差dv，然后通过电压/浓度校正曲线得出近端位置与远端位置之间Ca²⁺的浓度差dc，将浓度差dc和位移差dx代入Fick第一扩散定律公式J=-D•dc/dx，式中D为离子/分子特异的扩散常数，其单位是cm^-2•sec^-1；J为Ca²⁺的流动速率，其单位为picomole•cm^-2•sec^-1，其中J正值代表Ca²⁺外排，负值代表Ca²⁺内流。

2.根据权利要求1所述的一种非损伤检测脑片神经元钙离子跨膜流动的方法，其特征在于：所述测试液为急性给予的浓度分别为含10微摩尔、30微摩尔、50微摩尔的31-35片段淀粉样蛋白的人工脑脊液。

3.根据权利要求1所述的一种非损伤检测脑片神经元钙离子跨膜流动的方法，其特征在于：所述测试液为急性给予的细胞外低钙人工脑脊液，其中Ca²⁺浓度为0.35毫摩尔。

4.根据权利要求1所述的一种非损伤检测脑片神经元钙离子跨膜流动的方法，其特征在于：所述测试液为浓度为含50微摩尔的31-35片段淀粉样蛋白的人工脑脊液，将脑片放入所述测试液中并记录2分钟时间内测试液的基础流速，然后给予细胞外低钙人工脑脊液。

5.根据权利要求1所述的一种非损伤检测脑片神经元钙离子跨膜流动的方法，其特征在于：所述测试液为质膜钙泵抑制剂或质膜钠钙交换体抑制剂预处理后给予细胞外低钙人工脑脊液。

6.根据权利要求1所述的一种非损伤检测脑片神经元钙离子跨膜流动的方法，其特征在于：所述步骤a中Ca²⁺液态离子交换剂的添加量的高度为40~50微米，添加的Ca²⁺电解质溶液的添加量的高度为1厘米。

7.根据权利要求1或6所述的一种非损伤检测脑片神经元钙离子跨膜流动的方法，其特征在于：所述电解质溶液为CaCl₂溶液，其浓度为100毫摩尔CaCl₂。