[发明专利]一种非损伤检测脑片神经元钙离子跨膜流动的方法

说明书

技术领域

本发明属于钙离子跨膜流动检测方法技术领域，特别涉及一种非损伤检测脑片神经元钙离子跨膜流动的方法。

背景技术

Ca²⁺作为细胞内一种重要的第二信使，参与神经细胞的一系列活动，对神经细胞的代谢和功能产生广泛的影响。安静情况下，神经元胞浆内游离Ca²⁺的浓度很低，这使得细胞在受到刺激时能够通过显著的Ca²⁺内流改变功能活动。当大量Ca²⁺流入神经元内可使胞内出现钙超载，继而激活某些磷脂酶、蛋白酶、内切酶和一氧化氮合酶等，损害神经元功能，最终使神经元出现凋亡或死亡。为维持细胞内的Ca²⁺稳态，神经元主要是通过质膜钠钙交换体(Na⁺/Ca²⁺exchanger；NCX)和质膜钙离子ATP酶(plasma membrane calcium ATPase；PMCA)两种途径实现质膜对Ca²⁺的主动转运，即Ca²⁺外排。因此在神经科学的研究中，对生理和病理状态下神经元跨膜Ca²⁺流的动态变化进行快速、准确的检测，不仅可以帮助了解细胞维持Ca²⁺稳态和正常功能活动的原理，也有助于揭示Ca²⁺信号扰乱相关疾病的发生机制。目前，测定神经元跨膜Ca²⁺流的技术手段主要有：细胞内离子成像和电生理记录膜电流。然而，受技术所限，这些方法均有不到之处。细胞内Ca²⁺离子成像需要使用能与Ca²⁺结合的光敏染料(如Fura-2/AM和Fluo-4/AM等)，但存在荧光染料对细胞活性的影响、荧光染料随着时间的延长有不同程度的淬灭等缺点，且仅限于在培养细胞水平上观察胞内的Ca²⁺变化。电生理技术可以直接测定跨膜Ca²⁺电流，但该技术仅限于单一离子通道的记录和分析，不适合从整体上分析跨膜分子/离子的信息，并且存在封接成功率低、破膜过程会对细胞产生损害而记录时间短和封接不稳等问题。

非损伤微测技术(Non-invasive Micro-test Technique，NMT)是近年发展起来的一种以非接触方式直接获取离子跨膜内流或外流流速的最新技术手段，其根据Fick第一扩散定律和Nernst方程，通过检测细胞外两点间电位差的改变从而测得紧邻细胞膜的胞外离子变化情况。其优势在于：测量时，微电极不接触被测样品，不会对样品造成任何损伤；其空间分辨率高，可实现微米级的测量；测量数据精度高，对离子流动速率的测量可达到picomole·cm^-2·sec^-1。然而，目前针对动物组织特别是脑组织进行的NMT实时、动态Ca²⁺流研究尚未见报道，特别是记录Ca²⁺外排的研究尚未见报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的不足，为开展实验动物脑功能的跨膜Ca²⁺信号转导研究提供新的技术手段，本发明提供一种非损伤检测脑片神经元钙离子跨膜流动的方法。

本发明通过以下技术方案予以实现。

一种非损伤检测脑片神经元钙离子跨膜流动的方法，它包括测试电极与参比电极，所述测试电极中测试电极丝的材质为AgCl丝，参比电极材质为Ag/AgCl固态电极，按以下步骤依次进行：

a、测试电极的设置：

测试电极还包括锥形管，首先，向锥形管尖嘴部填充Ca²⁺液态离子交换剂；其次，再向锥形管中添加Ca²⁺电解质溶液；最后，将测试电极丝从锥形管圆口端插入锥形管内并与电解质溶液接触，形成测试电极；

b、测试电极与参比电极位置的设置：

在培养皿上方设置电极固定架，所述参比电极固定设置于电极固定架的一端，参比电极下端部延伸至培养皿内部并可以与脑片营养液接触；测试电极设置于电极固定架的另一端，测试电极与驱动装置连接，驱动装置精确驱动测试电极产生位移；测试电极与参比电极之间通过电位测试装置连接；