[发明专利]基于ALV‑Jgp85基因保守区域为靶序列的siRNA重组干扰载体及其制备方法在审
| 申请号： | 201710350007.X | 申请日： | 2017-05-17 |
| 公开（公告）号： | CN107058388A | 公开（公告）日： | 2017-08-18 |
| 发明（设计）人： | 王培坤;林璐璐;秦丽莉;杨永立;李海娟;磨美兰;韦天超;黄腾;韦平 | 申请（专利权）人： | 广西大学 |
| 主分类号： | C12N15/861 | 分类号： | C12N15/861;A61K48/00;A61K31/7088;A61P31/14 |
| 代理公司： | 广西南宁公平知识产权代理有限公司45104 | 代理人： | 杨立华 |
| 地址： | 530004 广西壮族*** | 国省代码： | 广西;45 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基于 alv jgp85 基因 保守 区域 序列 sirna 重组 干扰 载体 及其 制备 方法 | ||
1.一种基于ALV-J gp85基因保守区域为靶序列的siRNA重组干扰载体的制备方法，其特征在于：利用gp85基因设计合成siRNA，构建形成siRNA的发卡结构，进一步获得退火双链DNA后，将其克隆入腺病毒载体pHBAd-U6-RFP构建重组腺病毒载体pAd-gp85-shRNA2，测序鉴定构建成功后，在HEK 293细胞中与骨架质粒进行同源重组获得重组腺病毒。
2.根据权利要求1所述基于ALV-J gp85基因保守区域为靶序列的siRNA重组干扰载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)根据GenBank上HPRS103毒株以及J亚群毒株HG03 gp85基因保守区域为靶序列遵循Renylod规则，热动力学规则，靶mRNA的二级结构，以及载体pHBAd-U6-RFP的要求，设计了siRNA，方便连接载体，序列加入EcoRI和BamHI酶切位点；所述siRNA具有序列表SEQ ID NO：1的碱基序列；
(2)设计合成含步骤(1)目的片段的发夹结构合成shRNA，其中top strand DNA具有序列表SEQ ID NO：2的碱基序列，Bottom strand DNA具有序列表SEQ ID NO：3的碱基序列；将其退火形成双链DNA后连接到酶切好的腺病毒载体pHBAd-U6-RFP，获得得到重组腺病毒载体pAd-gp85-shRNA2；所述shRNA2具有序列表SEQ ID NO：1的碱基序列；
(3)取重组腺病毒载体质粒pAd-gp85-shRNA2和骨架质粒pHBAd-BHG，利用Lipofectamine2000转染试剂转染入HEK 293细胞即可得到重组腺病毒。
3.权利要求1至2所述任一制备方法得到的基于ALV-J gp85基因保守区域为靶序列的siRNA重组干扰载体。
4.权利要求3所述的基于ALV-J gp85基因保守区域为靶序列的siRNA重组干扰载体在制备干扰体外细胞及活鸡体内ALV-J转录与复制的药物方面的应用。
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