[发明专利]基于ALV‑Jgp85基因保守区域为靶序列的siRNA重组干扰载体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于siRNA重组技术领域，尤其涉及一种基于ALV-J gp85基因保守区域为靶序列的siRNA重组干扰载体及其制备方法。

背景技术

J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus，ALV-J)是一种最常见的外源性禽白血病病毒。ALV-J在国内的肉用鸡、父母代种鸡和商品代肉鸡中都存在严重感染，已经给养鸡业造成了巨大的损失，严重危害了我国鸡养殖业的发展。该病可以水平传播，也可垂直传播，国外现有的有效经验是将ALV病毒阳性或抗体阳性鸡淘汰，以净化AL，控制AL的传播。然而，该法净化周期长，成本高，只能在规模较大的养殖公司开展。

ALV基因组全长7.6kb～7.8k，基因组结构为：LTR-Leader-gag-pol-env-LTR。主要包含gag、pol和env三个基因。Env基因含有表面蛋白合成的遗传信息，编码病毒囊膜糖基化蛋白，包括膜表面糖蛋白亚单位gp85和跨膜蛋白亚单位gp37。gp85基因编码ALV的表面糖蛋白，是位于病毒表面的棒状结构，决定病毒亚群的特异性。gp85是亚群特异性蛋白，负责病毒对易感细胞的吸附，在病毒感染靶细胞时，病毒的囊膜糖蛋白与靶细胞表面相应的特异性受体相互识别结合是病毒进入靶细胞进行复制繁殖所必需的。

由于ALV-J的抗原性易发生改变，目前还未研发出可以有效治疗或预防的药物、疫苗。而腺病毒载体生产工艺简便、制备纯化相对容易、产毒滴度高、外源基因容量大(7Kb～8kb)、腺病毒载体携带的外源基因独立于靶细胞染色体之外表达，无插入突变激活癌基因的危险。此外，RNAi是一种强有效的抑制基因功能的工具，该技术在人类疾病上的应用比较多，技术也比较成熟。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于ALV-J gp85基因保守区域为靶序列的siRNA重组干扰载体及其制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：基于ALV-J gp85基因保守区域为靶序列的siRNA重组干扰载体的制备方法，利用gp85基因设计合成siRNA，构建形成siRMA的发卡结构，进一步获得退火双链DNA后，将其克隆入腺病毒载体pHBAd-U6-RFP构建重组腺病毒载体pAd-gp85-shRNA2，测序鉴定构建成功后，在HEK 293细胞中与骨架质粒进行同源重组获得重组腺病毒。

上述基于ALV-J gp85基因保守区域为靶序列的siRNA重组干扰载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)根据GenBank上HPRS103毒株(Z46390.1)以及J亚群毒株HG03gp85基因保守区域为靶序列遵循Renylod规则，热动力学规则，靶mRNA的二级结构，以及载体pHBAd-U6-RFP的要求，设计了siRNA，方便连接载体，序列加入EcoR I和BamH I酶切位点；

(2)设计合成含步骤(1)目的片段的发夹结构合成shRNA，其中top strand DNA具有序列表SEQ ID NO：2的碱基序列，Bottom strand DNA具有序列表SEQ ID NO：3的碱基序列；将其退火形成双链DNA后连接到酶切好的腺病毒载体pHBAd-U6-RFP，获得得到重组腺病毒载体pAd-gp85-shRNA2；所述shRNA2具有序列表SEQ ID NO：1的碱基序列；

(3)取重组腺病毒载体质粒pAd-gp85-shRNA2和骨架质粒pHBAd-BHG，利用Lipofectamine 2000转染试剂转染入HEK 293细胞即可得到重组腺病毒。

上述制备方法得到的基于ALV-J gp85基因保守区域为靶序列的siRNA重组干扰载体。

上述基于ALV-J gp85基因保守区域为靶序列的siRNA重组干扰载体在制备干扰体外细胞及活鸡体内ALV-J转录与复制的药物方面的应用。