[发明专利]一种活性多肽SPGP‑V的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型动物来源活性多肽及其制备方法，具体涉及一种通过阳离子交换HPLC以及两步反相HPLC分离获得新型生物活性多肽的方法。

背景技术

生物毒素是一种重要的生命现象，是生物界在亿万年进化过程中为了生存而形成的，是一个巨大的潜在发现新的生物活性分子的重要资源。目前国际上已经成功筛选到一些生物毒素分子用于治疗某些相关疾病或作为新型药物的设计参考。蜘蛛产生各种作用于神经系统的神经毒素，其神经毒素根据它们的化学结构分为蛋白多肽类神经毒素和多胺类神经毒素。其中蜘蛛多肽神经毒素最重要，蜘蛛多肽类神经毒素根据它们的功能和分子特征可分为两种类型:第一种是低分子量多肽类，它们能与兴奋性细胞膜上的阳离子通道相互作用；第二种是高分子量多肽类，它们与突触前膜的受体组分及增强神经介质的分泌作用密切相关。蜘蛛毒液已成为神经毒素的一个重要新来源，而且蜘蛛毒液中特异性药物和毒素分子也是我们寻找农业杀虫剂的较好模式分子。

发明内容

本发明的目的旨在于提供一种从广西捕鸟蛛粗毒中制备新型生物活性多肽的方法，所述的生物活性多肽为蜘蛛抑钙肽-V（SPGP-V），其氨基酸序列为：

NH₂-Glu Cys Arg Trp Tyr Leu Gly Gly Cys Ser Gln Asp Gly Asp Cys Cys Lys

His Leu Gln Cys His Ser Asn Tyr Glu Trp Cys Val Trp Asp Gly Thr Phe Ser-OH。

所述的蜘蛛抑钙肽-V的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之间，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间，N端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之间分别形成二硫键。

所述方法包括：（1）将广西捕鸟蛛粗毒干粉用双蒸水溶解配成5mg/mL的毒素溶液，12 000rpm离心5 min,置于4℃保存。粗毒上样阳离子交换HPLC进行第一步分离。采用Waters 650型HPLC、美国Pharmacia 公司的Hiprep^TM16/10 CM FF预装柱进行分离。486检测器检测，检测波长为 215nm。流动相为四相洗脱系统，流速为3 mL/min。洗脱液分别为A相0.1M磷酸二氢钠, B相0.1M 磷酸氢二钠, C相 1M氯化钠, D相双蒸水（ddH₂O）。其中A液和B液用来调节洗脱液的pH值，采用氯化钠梯度洗脱。上述经阳离子交换 HPLC分离后收集的各洗脱峰分别上样反相HPLC进行进一步纯化。（2）反相高效液相色谱分离脱盐纯化：在Pharmacia公司的AKTA蛋白纯化系统上完成，采用大连依利特公司的C18反相制备柱。（3）第三步采用分析型Vydac C18 RP-HPLC反相柱 (218TP54, 4.6×250 mm) 于分析型Waters 2690 高效液相色谱仪上进行梯度洗脱，996检测器检测，检测波长为280nm，流动相为含0.1%TFA的水（A）和乙腈（B），洗脱速度为1mL/min，柱温为40℃。

（2）通过上述阳离子交换HPLC以及两步反相HPLC共三步分离获得的SPGP-V，运用质谱鉴定纯度达到98%以上，其分子量约为4111.7 Da，经序列测定，该多肽的一级结构由35个氨基酸残基组成，其中含6个半胱氨酸并形成三对二硫键，C-端未酰胺化。多肽SPGP-V纯化冻干粉的理化性状为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明。

附图说明

图1是广西捕鸟蛛粗毒阳离子交换HPLC图谱。箭头表示目的峰，纵坐标表示洗脱峰在280 nm的吸收值，横坐标表示洗脱时间。

图2是广西捕鸟蛛粗毒目的阳离子交换峰反相HPLC图谱。“*”表示目的峰，纵坐标表示各个洗脱峰在280 nm下的吸收值，横坐标表示洗脱时间。

图3是SPGP-V的反相HPLC图谱。

图4是SPGP-V的MALDI-TOF质谱图谱。

具体实施方式

1、实验材料和方法

1.1 粗毒的获取

广西捕鸟蛛采集于广西省境内的山区，粗毒毒液采于雌性蛛种。简述如下：使蜘蛛张开螯爪伸入塑料杯中，然后用5～10 V的脉冲电流刺激两螯肢基部外侧3～5 s。蜘蛛感受电刺激后，即用触肢紧紧抱住杯壁，同时将螯爪有力刺向杯内壁并射出毒液。毒液收集后，放入-40℃冷冻干燥机中经真空冷冻干燥成浅黄色或白色粉末即为粗毒。

1.2粗毒的分级分离及质谱鉴定