[发明专利]无碳源阻遏毕赤酵母表达系统、其建立方法及应用

权利要求书

1.一种无碳源阻遏性表达外源多肽的方法，包括：

(1) 提供甲醇营养型酵母，所述甲醇营养型酵母为毕赤酵母(Pichia)，含有：

表达盒1，其表达外源的DNA结合蛋白和转录激活因子的融合多肽，所述的转录激活因子是甲醇营养型酵母中具备独立招募RNA聚合酶能力的转录因子蛋白，所述的转录激活因子为转录激活因子的激活域；所述的DNA结合蛋白为LacI；所述转录激活因子的激活域为Mit1AD，Mxr1AD或Prm1AD；以及

表达盒2，从5’→3’依次包括操作性连接的：蛋白结合序列、核心甲醇诱导型启动子，外源多肽编码基因；所述的蛋白结合序列与表达盒1中的DNA结合蛋白能发生结合；所述蛋白结合序列为lacO，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 8所示；所述核心甲醇诱导型启动子为AOX1核心启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示；

(2) 在无甲醇条件或非单一甲醇碳源条件下、培养(1)的甲醇营养型酵母，表达外源多肽。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达盒1中还包括启动子，所述的启动子包括：组成型启动子或葡萄糖浓度控制型启动子。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的组成型启动子包括GAP启动子。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的葡萄糖浓度控制型启动子包括：MSC1启动子、MAL31启动子、GAL4启动子。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的LacI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Mit1AD基因的核苷酸序列如SEQ IDNO: 4所示。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Mxr1AD基因的核苷酸序列如SEQ IDNO: 5所示。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Prm1AD基因的核苷酸序列如SEQ IDNO: 6所示。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白结合序列以1～15拷贝存在。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的蛋白结合序列以1～9拷贝存在。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养是以甘油和/或葡萄糖为碳源的培养。

12.DNA结合蛋白和转录激活因子的融合多肽或其编码基因的用途，用于甲醇营养型酵母消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性或碳源阻遏而更加强力的驱动外源多肽编码基因表达；所述的DNA结合蛋白为LacI；所述转录激活因子的激活域为Mit1AD，Mxr1AD或Prm1AD；所述甲醇营养型酵母为毕赤酵母(Pichia)。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的碳源是甘油和/或葡萄糖。