[发明专利]无碳源阻遏毕赤酵母表达系统、其建立方法及应用

说明书

本发明涉及一种高表达量的、无碳源阻遏的、增强型甲醇营养型酵母表达系统，其建立方法及应用。本发明揭示了一种消除甲醇诱导型启动子单一甲醇碳源依赖性和碳源严重阻遏的方法，通过人工改造甲醇营养型酵母细胞内的转录调控遗传线路，提高启动子转录强度并改变其调控模式。本发明的酵母表达系统以及表达方法，使得原本依赖甲醇诱导、存在碳源阻遏的启动子不再依赖甲醇，在其它碳源条件下也可高效地表达外源多肽，最高表达量可达野生型AOX1启动子甲醇条件下的5倍。

技术领域

本发明属于生物工程领域；更具体的，本发明涉及一种无碳源阻遏毕赤酵母表达系统、其建立方法及应用。

背景技术

近年来，生物制品在人们生产生活中所占的比重越来越高，而大部分生物制品如：疫苗、抗体、抗菌肽、抗生素等几乎都是通过异源表达的方式进行生产。而在采用模式生物异源表达生物制品的过程中，由启动子引导的转录起始过程是蛋白表达的关键步骤。因此强力可调控的启动子一直是高水平表达外源蛋白所必不可少的工具。

毕赤酵母中的醇氧化酶(Aox1)启动子(P_AOX1)是目前最强力的启动子，已用于表达多种外源蛋白，胞内表达量和胞外表达量最高分别可达到22g/L的和15g/L。因此，P_AOX1常被用来进行改造以获得具有更高启动强度、不依赖甲醇诱导的合成型启动子。目前对于P_AOX1的改造主要针对于其启动子序列的缺失或者插入及转录调控因子表达水平的调控。在这些研究中在甲醇诱导下相对野生型活性最好的的突变启动子分别为Hartner等的160％、Xuan等的157％。但是由于P_AOX1的调控网络尚未完全清晰，在大规模应用中还存在诸多问题。近年来已经商业化的不依赖甲醇的启动子只有奥地利VTU Technology公司，他们通过对P_AOX1序列进行的改造开发的2nd P_AOX1在甘油诱导下能够达到1nd P_AOX1(野生型菌株的P_AOX1)在甲醇诱导下的18.2％～114.3％，并且要高于P_GAP的表达水平，已经达到工业应用的水平。尽管非甲醇诱导P_AOX1的研究已经取得了很大的突破，但是仍旧无法改变P_AOX1调控模式单一，碳源严重阻遏等问题。

因此，如果得到一种调控更加灵活、能够利用非甲醇诱导启动子表达的方法，使原本依赖甲醇诱导的启动子在其它碳源作为单一碳源的条件下也能够更为高效的转录，这对于实现工业上利用毕赤酵母灵活、高效的表达外源多肽具有积极意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过人工改造甲醇诱导/碳源阻遏型启动子转录调控遗传线路从而构建更为强力的新型表达系统的方法。

在本发明的第一方面，提供一种无碳源阻遏性表达外源多肽的方法，包括：

(1)提供甲醇营养型酵母，所述甲醇营养型酵母含有：

表达盒1，其表达外源的DNA结合蛋白和转录激活因子的融合多肽，以及

表达盒2，从5’→3’依次包括操作性连接的：蛋白结合序列、甲醇诱导型启动子，外源多肽编码基因；

(2)在无甲醇条件或非单一甲醇碳源条件下、培养(1)的甲醇营养型酵母，表达外源多肽。

在一个优选例中，所述的甲醇营养型酵母包括：毕赤酵母(Pichia)，汉逊酵母(Hansenula)，假丝酵母(Candida)，球拟酵母(Torulopsis)；较佳地，所述的甲醇营养型酵母是毕赤酵母。

在另一优选例中，所述的毕赤酵母是：GS115毕赤酵母菌株。

在另一优选例中，所述的表达盒1中，包括启动子以及与之操作性连接的DNA结合蛋白和转录激活因子的融合多肽的编码基因。