[发明专利]可诱导肿瘤细胞程序性坏死的蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种可诱导肿瘤细胞程序性坏死的蛋白及其制备方法和应用。蛋白的制备方法：将黍子籽粒或黍糠粉碎，加入蛋白提取液低温提取，随后加入硫酸铵沉淀蛋白，再经过脱盐，阳离子交换层析和凝胶层析等步骤获得纯的蛋白。经实验这种蛋白可以诱导结直肠癌、肝癌等多种肿瘤细胞发生程序性坏死，其可以在制备抗肿瘤药物和保健食品中应用。

技术领域

本发明涉及植物功能蛋白制备和应用，具体属于一种来源于黍子籽粒或黍糠的可以诱导肿瘤细胞程序性坏死的蛋白及其制备方法，以及该蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

黍子(Panicum miliaceum L.)属禾本科黍属，一年生草本植物，主要生长在北方。籽实也叫黍子，糜子，淡黄色，去皮后俗称黄米，常用于制作年糕，酿酒的原料，是重要的粮食作物之一。

黍子种子中含有17种氨基酸，含量较高，特别是必需氨基酸含量为4.76mg/100g，含量明显高于小麦，且与标准食谱相近，易于人体吸收，可以作为人体营养的补充食物。黍子籽粒中的钙、镁、磷及微量元素铁、铜、锌含量是水稻的3.4倍、小麦的2.3倍、玉米的1.05倍，并且含有一定量的硒。这些微量元素对于活化人体免疫性和正常的生理功能，抗衰老、预防心血管病等方面有着重要的作用。此外，黍子具有一定的药用价值，是我国传统的中草药之一。黍子性味甘、平、微寒、无毒。据《名医别录》记载：稷米“入脾、胃经”，功能“和中益气、凉血解暑”。煮熟和研末食，主治气虚乏力、中暑、头晕、口渴等症。黍米“入脾、胃、大肠、肺经”，功能“补中益气、健脾益肺、除热愈疮”。主治脾胃虚弱、肺虚咳嗽、呃逆烦渴、泄泻、胃痛、小儿鹅口疮、烫伤等症。

目前国内外关于黍子中活性物质的研究还较少，仅仅集中在其化学成分(植物多酚)和营养价值方面。黍糠是黍子加工过程中脱壳而得到的皮壳，也含有多种生物活性成分，是一种廉价而潜在的资源。本发明发现的来源于黍子，可诱导肿瘤细胞程序性坏死的蛋白具有较高的抗肿瘤活性，可在制备抗肿瘤药物中应用。另外，这一发现将为进一步研究开发黍子高附加值产品以及黍子资源的综合利用提供思路和依据，从而有利于推动黍子产业的规模化和持续化发展，带动我国半干旱、高海拔地区的经济发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可诱导肿瘤细胞程序性坏死的蛋白及其制备方法，以及将该蛋白在制备抗肿瘤药物中得到应用。

本发明提供的一种可诱导肿瘤细胞程序性坏死的蛋白，来源于黍子(PanicummiliaceumL.)籽粒或黍糠，其分子量为37kD，氨基酸序列为SEQ ID No.1。

本发明提供的一种可诱导肿瘤细胞程序性坏死的蛋白，可以通过如下步骤的方法制得：

第一步：取干燥的黍子籽粒或黍糠，进一步粉碎后，然后按每克粉末加入10-15mL预冷的酸性蛋白提取液，4℃下搅拌4-8小时，8000-12000rpm离心10-20分钟除去沉淀，收集上清，得到蛋白粗提液；所述的酸性蛋白提取液为20mmol/L醋酸铵缓冲液，pH4.5；

第二步：在蛋白粗提液中加入硫酸铵，至60％-80％的饱和度，在4℃搅拌3-5小时；8000-12000rpm离心20-30分钟，收集沉淀；

第三步：用少量pH7.0的磷酸盐缓冲液溶解沉淀，上样于脱盐柱，除去硫酸铵，收集蛋白峰得到蛋白粗品；

第四步：将蛋白粗品上样于HiTrap^TM SP弱阳离子交换进行分离纯化，收集洗脱峰，将收集的洗脱峰蛋白上样于凝胶层析柱，收集活性蛋白峰，真空冷冻干燥，得到可以诱导肿瘤细胞程序性坏死的蛋白。采用SDS-PAGE分析，该蛋白的分子量约为37kD。经胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解及肽质量指纹图谱鉴定，并结合Edman降解法测定其N端序列，确定氨基酸序列为SEQ ID No.1。

本发明提供的肿瘤细胞程序性坏死蛋白是一种热稳定性较好，经紫外-可见分光光度计检测，该蛋白在280nm和400nm处有吸收峰。