[发明专利]一株利用木质纤维素水解液厌氧发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一株利用木质纤维素水解液厌氧发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 以SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列为引物，质粒pIJ773为模板，PCR扩增得到线性片段1；

以SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列为引物，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列为模板，PCR扩增得到线性片段2；

以SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列为引物，线性片段1和线性片段2为模板扩增得到基因敲除片段A；

(2) 将pKD46质粒转化CGMCC NO：2301菌株，利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将该菌株制备成感受态Ⅰ；

(3) 将步骤(1)中基因敲除片段A转化步骤(2)得到的感受态Ⅰ中，涂布安普霉素的平板筛选出阳性重组子A；

(4) 将pCP20转化到步骤(3)得到的阳性重组子A中，42℃热激使其表达FLP重组酶，利用无抗性平板和含有安普霉素抗性的平板进行双挑，能够在无抗性平板上生长，但不能在安普霉素抗性平板上生长的菌株即为大肠杆菌AS12；

(5) 将pKD46质粒转化大肠杆菌AS12，利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将该菌株制备成感受态Ⅱ；

(6) 以SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11为引物，质粒pIJ773为模板，PCR扩增得到基因敲除片段B；

(7) 将步骤(6)得到的基因敲除片段B转化步骤(5)得到的感受态Ⅱ中，涂布安普霉素的平板筛选出阳性重组子B；

(8) 将pCP20转化到步骤(7)得到的阳性重组子B中，42℃热激使其表达FLP重组酶，利用无抗性平板和含有安普霉素抗性的平板进行双挑，能够在无抗性平板上生长，但不能在安普霉素抗性平板上生长的菌株即为重组大肠杆菌AS31；

(9) 将SEQ ID NO：12所示的序列插入表达质粒pTrc99a中，得到重组质粒，将该重组质粒转化重组大肠杆菌AS31，得到所述利用木质纤维素水解液发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌AS32。

2.权利要求1所述利用木质纤维素水解液厌氧发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌的构建方法构建得到的基因工程菌。

3.权利要求2所述基因工程菌在发酵制备L-天冬氨酸中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵过程如下：

(S1) 将基因工程菌AS32转接到摇瓶LB培养基中，有氧培养10~12h，得到一级种子液；

(S2) 将一级种子液转接到发酵罐LB培养基中，培养，得到二级种子液；

(S3) 待二级种子液OD₆₀₀至2.5~4时，再接种到发酵培养基，所述发酵培养基的配方如下：

谷氨酸9 g/L、玉米浆干粉 5 g/L、柠檬酸 3.0 g/L、Na₂HPO₄∙7H₂O 3.00 g/L、KH₂PO₄8.00 g/L、(NH₄)₂HPO₄ 20.00 g/L、NH₄Cl 10 g/L、(NH₄)₂SO₄ 5 g/L、MgSO₄∙7H₂O 1.00 g/L溶剂为水；

发酵过程中，分次加入灭菌葡萄糖或是木质纤维素水解液，使培养基中总糖的浓度为1~50g/L；

发酵过程中，谷氨酸浓度控制为6~15g/L。

5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于，步骤(S1)和(S2)中，培养温度为35~38℃。

6.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于，步骤(S3)中采用两阶段发酵模式，当菌体OD₆₀₀为20以下时，通氧气进行有氧发酵，溶解氧为5~40%；当菌体OD₆₀₀至20以上时改通二氧化碳气体进行厌氧发酵，通气量控制在0.01~0.5 VVM。

7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于，两阶段发酵过程中温度为25~30℃，培养过程pH用氨水调节为7.0~8.5。