[发明专利]一株利用木质纤维素水解液厌氧发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一株能够利用木质纤维素水解液为原料，同步利用葡萄糖、木糖的混合糖厌氧发酵产L‑天冬氨酸基因工程菌，该菌株具体的构建方法为：以重组菌AS12为出发菌，采用代谢工程改造策略敲除糖转运系统的ptsG基因，得到重组大肠杆菌AS31；将能够催化草酰乙酸合成L‑天冬氨酸的天冬氨酸转氨酶基因aspC和磷酸烯醇式丙酮酸激酶编码基因pck克隆到表达质粒上，将该重组质粒转化大肠杆菌AS31，即得到利用木糖、葡萄糖混合糖同步厌氧发酵产L‑天冬氨酸的基因工程菌AS32。本发明还公布了AS32厌氧发酵产L‑天冬氨酸的培养基和培养条件，实现了利用如秸秆、玉米芯、稻草等废弃生物质资源为原料发酵制备L‑天冬氨酸的目标，具有显著的经济性。

技术领域

本发明属于基因工程及发酵工程技术领域，具体涉及一株利用木质纤维素水解液发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌构建方法与应用。

背景技术

L-天冬氨酸在医药、食品和化工等方面有着广泛的用途。在医药方面，是氨基酸制剂的主要成分；在化工方面，可以作为制造合成树脂的原料，大量用于合成环保材料聚天门冬氨酸；尤其在食品工业方面，L-天门冬氨酸是一种良好的营养增补剂，也是糖代用品阿斯巴甜的主要生产原料。L-天冬氨酸需求约7万吨/年，市场需求量大。

目前L-天冬氨酸主要以富马酸为原料，采用生物酶法合成，而目前富马酸主要采用化学法制备，因此从全周期分析，L-天冬氨酸的制备仍然依赖化石资源。葡萄糖、木糖等单糖可来源于可再生的生物质资源，其产量丰富，筛选或构建获得一株能够直接通过发酵制备L-天冬氨酸的生产菌株具有重要的意义。国内全生物合成上述产品尚处于实验室研究阶段，其产业化实施经济性偏低，造成这一现状的主要问题包括：1)原料成本高；2)原料转化率低。

先期已获得了一株有氧条件下能够利用葡萄糖发酵制备L-天冬氨酸的菌株(CN106434510A)，但该菌株因有氧条件下菌株生物量高且脱羧反应导致二氧化碳释放，导致收率偏低仅0.55g/L，生产成本高。与有氧发酵相比，厌氧发酵具有收率高的特点，因此构建了一株在厌氧条件下能够利用单糖发酵制备L-天冬氨酸的菌株 (CN105296411A)，但厌氧环境下菌株生长稳定性偏差，且产物浓度仅10g/L，因此进一步构建筛选获得了一株在厌氧条件下生长性能优良且浓度更高的菌株具有显著意义，同时为了能实现利用木质纤维素水解液的目标，在菌株构建过程中提高木糖利用效率，及混合糖的同步利用均需考虑。本发明基于此，公开了相关的技术。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一株利用木质纤维素水解液发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述基因工程菌在发酵产L-天冬氨酸中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一株利用木质纤维素水解液厌氧发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，敲除保藏号为CGMCC NO：2301菌株中苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceBA，并在 aceBA基因的位置处插入L-天冬氨酸酶基因，再敲除该菌种中糖转运系统的ptsG基因，得到重组大肠杆菌AS31；基因的敲除和敲除插入采用通用的RED重组技术。

将能够催化草酰乙酸合成L-天冬氨酸的天冬氨酸转氨酶基因aspC、磷酸烯醇式丙酮酸激酶编码基因pck克隆到表达质粒上，将该重组质粒转化大肠杆菌AS31，即得到木质纤维素水解液厌氧发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌AS32。基因的表达采用具有较高本底表达水平的pTrc99a大肠杆菌表达质粒，aspC基因和pck基因的表达采用单质粒表达模式，两个基因采用人工合成基因序列的方式，各自带有自身独立的启动子序列。

本发明中，

所述苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceBA的GenBank登记号为EU889415.1；