[发明专利]一种蛋白制剂及在CIK细胞培养方面的应用

权利要求书

1.一种蛋白制剂在体外培养扩增CIK细胞方面的应用，其特征在于，该蛋白制剂通过如下步骤制备得到：

步骤1、单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g、4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，RPMI-1640培养基重悬细胞后置于37℃、5% CO₂孵箱中孵育2h；

步骤2、DC细胞的培养：单个核细胞培养2h后收集贴壁细胞，在含有10% FBS的RPMI-1640完全培养基中添加1000U/mL GM-CSF、1000U/mL IL-4诱导DC生成，于37℃、5% CO₂孵育箱中培养，每2天半量换液一次，换液后补充GM-CSF、IL-4，于第6d在培养基中添加100ng/mLTNF-α诱导DC成熟，连续培养7d；

步骤3、总蛋白提取：提取前3小时，将成熟DC置于37℃、25%-45% CO₂孵育箱中培养2-4小时；2-4小时后，按照如下方法提取总蛋白，分装后-70℃保存，避免反复冻融：

（1）吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，收集至离心管，1000rpm离心5分钟，洗涤后的细胞转移至洁净EP管；

（2）冰上操作，配制细胞裂解液，1mL Lysis Buffer中加入10μL磷酸酶抑制剂、1μL蛋白酶抑制剂、5μL 100mM的PMSF，混匀后冰上保存数分钟待用；

（3）在洗涤好的细胞中按照每10⁷个细胞加入1mL细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液，移液器反复吹打使细胞充分裂解；

（4）4℃摇床温和振摇15分钟，然后用4℃离心机14000rpm离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物；

（5）BCA法测蛋白浓度；提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。