[发明专利]一种抑制CTLA‑4表达促进CIK细胞体外增殖方法在审
| 申请号： | 201710362198.1 | 申请日： | 2017-05-22 |
| 公开（公告）号： | CN107164320A | 公开（公告）日： | 2017-09-15 |
| 发明（设计）人： | 吴国清;朱秀明;王夫伟;郑爱红;姜华 | 申请（专利权）人： | 吴国清 |
| 主分类号： | C12N5/0783 | 分类号： | C12N5/0783;C12Q1/68;G01N33/68 |
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| 地址： | 310000 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 抑制 ctla 表达 促进 cik 细胞 体外 增殖 方法 | ||
1.一种抑制CTLA-4表达促进CIK细胞体外增殖方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)从外周血中采集和分离单核细胞，将单核细胞放在培养瓶中进行培养；
(2)将培养后的单核细胞用细胞因子诱导，抑制了CTLA-4分子表达，促进了CIK细胞的体外增殖；
(3)将得到的CIK细胞分别用基因水平验证法和蛋白水平验证法进行检验，确定CIK细胞的体外增殖量。
2.根据权利要求1所述的一种抑制CTLA-4表达促进CIK细胞体外增殖方法，其特征在于：所述单核细胞放在培养瓶中进行培养时间为8-12天。
3.根据权利要求1所述的一种抑制CTLA-4表达促进CIK细胞体外增殖方法，其特征在于：所述细胞因子为ShCTLA-4慢病毒，所述ShCTLA-4慢病毒含干扰序列为5’-GGAATGAGTTGACCTTCCTAGATGA-3’。
4.根据权利要求1所述的一种抑制CTLA-4表达促进CIK细胞体外增殖方法，其特征在于：所述细胞因子的诱导时间为92-100h。
5.根据权利要求1所述的一种抑制CTLA-4表达促进CIK细胞体外增殖方法，其特征在于：所述基因水平验证法采用PCR法，具体过程：使用QIAGE RNease Mini Kit纯化总RNA，经反转录后，以正向引物
5’-GACCTGGCCCTGCACTCTCCTGTTT-3’和反向引物
5'-ACTGTCACCCGGACCTCAGTGGCTT-3'扩增CTLA-4分子，内参GAPDH的扩增引物为5'-TGCCTCCTGCACCACCAACT-3'和5'-CCCGTTCAGCTCAGGGATGA-3'。
6.根据权利要求5所述的一种抑制CTLA-4表达促进CIK细胞体外增殖方法，其特征在于：所述PCR法的反应条件：反应温度为94℃，反应时间为30seconds。
7.根据权利要求5所述的一种抑制CTLA-4表达促进CIK细胞体外增殖方法，其特征在于：所述PCR法的反应条件：反应温度为55℃，反应时间为30seconds。
8.根据权利要求5所述的一种抑制CTLA-4表达促进CIK细胞体外增殖方法，其特征在于：所述PCR法的反应条件：反应温度为94℃，反应时间为72seconds。
9.根据权利要求1所述的一种抑制CTLA-4表达促进CIK细胞体外增殖方法，其特征在于：所述蛋白水平验证法采用western blot法，所述western blot法的具体过程：先以RIPA裂解缓冲液裂解1×107个CIK细胞，然后再以10％SDS-PAGE进行电泳和转膜；之后用2.5％脱脂奶粉封闭膜1h，接着以兔抗-CTLA4、GAPDH抗体孵育2小时，以羊抗兔IgG孵育1小时，最后加入发光液进行显影发光，通过在倒置荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光蛋白情况确定细胞的感染效率。
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