[发明专利]一种抑制CTLA‑4表达促进CIK细胞体外增殖方法

说明书

技术领域

本发明生物科学技术领域，具体涉及一种抑制CTLA-4表达促进CIK细胞体外增殖方法。

背景技术

肿瘤生物治疗，是除传统的手术治疗、放疗、化疗之外的第四种主要治疗模式。其治疗方法，简言之，就是通过调动宿主的天然防御机制或应用生物学物质或生物制剂等刺激机体自身的抗肿瘤生物学反应，从而达到杀伤肿瘤、抑制或消除肿瘤生长的目的。需要指出的是，肿瘤生物治疗是传统治疗肿瘤手段的重要补充，目前还不能取代传统治疗手段的作用，主要在肿瘤治疗维持阶段发挥作用。

CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced killer，CIK)是一种新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性，是目前国际上公认用于肿瘤生物治疗最有效的细胞之一。与过去过继免疫治疗所使用过的淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activated killer，LAK)和CD3单抗活化的杀伤细胞(CD3AK)相比，CIK细胞具有更强的细胞增殖能力和更强的抗肿瘤细胞作用，且毒副作用较小。

其中细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIK)是将人的外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，由于该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具T淋巴细胞的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。CIK细胞能以不同的机制识别和杀伤肿瘤细胞：①自然杀伤：CIK细胞是非MHC限制性的细胞毒细胞可通过分泌穿孔素和颗粒酶直接裂解肿瘤细胞；②炎症细胞因子作用：CIK细胞活化后能分泌多种抗肿瘤的细胞因子，具有抑瘤杀瘤作用，且对正常组织无毒性作用；③CIK细胞诱导肿瘤凋亡杀伤肿瘤细胞；④CIK细胞回输后可以激活机体免疫系统，通过增强T细胞功能起作用，提高机体的免疫功能。目前CIK细胞的研究亟待解决的问题包括，治疗效果不稳定，肿瘤免疫反应有待近一步提高。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxicT lymphocyte associated antigen 4，CTLA-4)与CD28分子都是共刺激分子B7的受体，主要表达于被激活T细胞的表面。而CTLA-4与B7结合后能抑制小鼠和人T细胞的激活，在T细胞活化中起负调节作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制CTLA-4表达促进CIK细胞体外增殖方法，通过生物手段抑制免疫反应负调控因子CTLA-4，以期提高CIK细胞的体外增殖。

为了解决上述技术问题，采用如下技术方案：

一种抑制CTLA-4表达促进CIK细胞体外增殖方法，包括以下步骤：

(1)从外周血中采集和分离单核细胞，将单核细胞放在培养瓶中进行培养。

(2)将培养后的单核细胞用细胞因子诱导，抑制了CTLA-4分子表达，促进了CIK细胞的体外增殖。

(3)将得到的CIK细胞分别用基因水平验证法和蛋白水平验证法进行检验，确定CIK细胞的体外增殖量。

进一步，单核细胞放在培养瓶中进行培养时间为8-12天。

进一步，细胞因子为ShCTLA-4慢病毒，ShCTLA-4慢病毒含干扰序列为5’-GGAATGAGTTGACCTTCCTAGATGA-3’。

进一步，细胞因子的诱导时间为92-100h。

进一步，基因水平验证法采用PCR法，具体过程：使用QIAGE RNease Mini Kit纯化总RNA，经反转录后，以正向引物5’-GACCTGGCCCTGCACTCTCCTGTTT-3’和反向引物5'-ACTGTCACCCGGACCTCAGTGGCTT-3'扩增CTLA-4分子，内参GAPDH的扩增引物为5'-TGCCTCCTGCACCACCAACT-3'和5'-CCCGTTCAGCTCAGGGATGA-3'。

优选后，PCR法的反应条件：反应温度为94℃，反应时间为30seconds，55℃。

优选后，PCR法的反应条件：反应温度为55℃，反应时间为30seconds，30℃。

优选后，PCR法的反应条件：反应温度为94℃，反应时间为72seconds，30℃。