[发明专利]一种检测CALR基因2型突变的引物组合物及试剂盒

说明书

本发明涉及一种用于检测CALR基因2型突变的引物组合物，其包括含有SEQ ID NO：2‑SEQ ID NO：7所示序列的引物；本发明还涉及一种含有上述引物组合物的试剂盒及其检测方法，以及上述引物组合物扩增的CALR基因2型突变的靶序列，该靶序列为SEQ ID NO：1所示序列。本发明所述的试剂盒及其检测方法具有良好的特异性和稳定性，梯度突变负荷浓度的样本用所建立的LAMP反应体系进行扩增，发现突变负荷检出敏感性可达到3％，几乎与探针法实时PCR的效果相当，且其可对CALR基因2型突变进行可视化检测，与传统的检测方法相比，该方法对设备和环境要求低，检测速度更快，检测灵敏度更高。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种检测CALR基因2型突变的靶序列、扩增组合物及试剂盒。

背景技术

骨髓增殖性肿瘤(MPN)是骨髓中一种或多种髓系细胞增殖和外周血中成熟及不成熟细胞增加的克隆性造血干/祖细胞疾病。近年来，多个分子标志物，如JAK2、MPL和TET突变等相继被发现，这些标志物的发现对于理解MPN的分子发病机制具有重要意义，也有助于对这类疾病的患者进行诊断和治疗。但是，有30％～45％的携有野生型JAK2/MPL的原发性血小板增多症(ET)或原发性骨髓纤维化(PMF)患者仍然存在诊断困难，新近报道的钙网蛋白基因(CALR)突变将能部分填补这一空白，有望成为诊断骨髓增殖性肿瘤又一种新的分子标志物。

CALR是一种主要位于内质网的有多重功能的钙离子结合和储存蛋白分子伴侣，通过协助蛋白质正确折叠和维持细胞钙离子稳态而参与调节细胞增殖、凋亡、黏附、免疫等过程。CALR基因定位于染色体19p13.2，它有9个外显子和9个蛋白结构域，CALR基因突变是由第九外显子插入和缺失引起，导致一个碱基对的读码框移位，继而产生一种具有缺乏内质网保留序列(KDEL氨基酸序列)的新型的C-羧基末端的蛋白,到目前为止，已经检测到多于40种不同的CALR突变体,其中最常见的两种变异体分别为：由52个碱基缺失引起的1型变异体(p.L367fs*46)和由5个碱基TTGTC插入引起的2型变异体(p.K385fs*47)，它们分别占所有突变体的53％和32％，研究者在体外实验中发现，过度表达的1型突变体增强了白介素-3表达，也促进了STAT5磷酸化作用并且引起信号传导的激活，这种激活作用能被JAK抑制剂阻滞，这说明CALR和JAK2突变可能有类似的机制。

当前CALR基因突变的检测主要依赖于探针实时PCR法或测序法等，以上方法耗时耗力、报告周期长，且在灵敏度方面存在缺陷，所需检测设备昂贵，检测时必须要有专门的设备和训练有素的技术人员，对技术平台要求高，不易于广泛推广。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，建立了一种针对CALR基因2型突变进行快速检测的环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)体系。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种检测CALR基因2型突变的靶序列的引物组合物，其包括SEQ IDNO：2-SEQ ID NO：7所示序列的引物。

本发明还提供一种含有上述引物组合物的检测CALR基因2型突变的试剂盒。

优选地，上述试剂盒还包括反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、钙黄绿素、去离子水、DNA模板。

优选地，上述试剂盒包含25μL扩增反应体系，该扩增反应体系包括包括2×反应缓冲液12.5μL，SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：4所示序列中的每一引物各0.5μL，SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：7所示序列中的每一引物各1μL，Bst DNA聚合酶1μL，钙黄绿素1μL，去离子水4.0μL，DNA模板2μL。