[发明专利]一种根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法有效
| 申请号： | 201710364404.2 | 申请日： | 2017-05-22 |
| 公开（公告）号： | CN107177622B | 公开（公告）日： | 2019-09-10 |
| 发明（设计）人： | 彭丽桃;李倩如;程晨;杨书珍 | 申请（专利权）人： | 华中农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/80 | 分类号： | C12N15/80 |
| 代理公司： | 武汉开元知识产权代理有限公司 42104 | 代理人： | 徐绍新 |
| 地址： | 430070 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 根癌农 杆菌 意大利 青霉 遗传 转化 方法 | ||
1.一种根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法，其特征在于包括以下步骤：
1)以潮霉素B抗性基因作为筛选标记，以pacC基因的上、下游序列作为同源臂，敲除意大利青霉pacC基因，构建含有潮霉素B抗性基因的基因敲除载体pacC3300；
2)将步骤1)的基因敲除载体pacC3300转化根癌农杆菌感受态细胞，得到含有敲除载体的根癌农杆菌；
3)将含有敲除载体的根癌农杆菌在含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基上扩大培养至OD600为0.8，然后再转入含有诱导剂的IM培养基培养至OD600为0.5，得到根癌农杆菌菌液；
4)将萌发的意大利青霉制成浓度为1x105cfu/mL的孢子悬浮液；
5)将步骤2)的根癌农杆菌菌液与步骤3)的意大利青霉孢子悬浮液按1:1的体积比混合，在带有承载膜的Co-IM固体培养基上共培养，培养温度25℃，培养时间36h-48h，最后转入含有50ug/ml的潮霉素B和200ug/ml的头孢霉素的PDA培养基中进行抗性培养，筛选获得转化子，
所述pacC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述潮霉素B抗性基因如SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述的根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法，其特征在于：所述根癌农杆菌为农杆菌AGL-1。
3.如权利要求1所述的根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法，其特征在于：所述诱导剂为乙酰丁香酮。
4.如权利要求1所述的根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法，其特征在于：所述的承载膜是玻璃纸。
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