[发明专利]一种根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及意大利青霉(penicillium italicum)的遗传转化方法，属于遗传转化领域。

背景技术

柑橘类水果以其独特的香气和味道，在日常销售的水果中非常受欢迎并在营养供给和促进健康等方面发挥重要作用。意大利青霉在柑橘的采后贮藏、运输期间引起大批量的果实腐烂，给农业生产带来巨大的经济损失。通过农杆菌介导的遗传转化技术，可对意大利青霉的特定基因的功能进行探索，从而进一步探究意大利青霉的致病机理、更有效的防治该病害。

跟癌农杆菌介导转化是目前应用最为广泛的遗传转化方法。根癌农杆菌是一种特殊的植物病原菌，能够通过位于Ti质粒上的T-DNA经IV型分泌系统转移到宿主上，T-DNA上的基因编码酶可以影响植物生长调节剂的产生，并且它们的表达导致植物细胞的不受控制的生长，形成冠状肿瘤。根癌农杆菌的这种DNA转移能力可用于真菌的转化，为此使用二元载体系统，即含有24bp边界重复的目的DNA的双元载体和含有对DNA转移十分重要Vir区域(毒力区域)的Ti质粒。Vir区编码的蛋白质参与T-DNA的形成和转运。酚类化合物如乙酰丁香酮，可诱导农杆菌Vir区基因的活化和表达。

农杆菌介导转化有着以下优点：(1)转化效率相比其他方法来说显著提高；(2)该方法可以适用于大多数的真菌，包括一些顽抗的真菌；(3)农杆菌介导转化可以使用多种起始材料，除原生质体之外，还可以使用较易获得的分生孢子、菌丝体、子实体，从而避免了原生质体提取的繁琐过程；(4)农杆菌介导转化的单拷贝数较高；⁽⁵)农杆菌介导转化的遗传稳定性比较高。

发明内容

本发明的目的之一是提供根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法，包括以下步骤：

1)以潮霉素B抗性基因作为筛选标记，以pacC的上、下游序列作为同源臂，敲除意大利青霉的pacC基因，构建含有潮霉素B抗性基因的基因敲除载体pacC3300；

2)将步骤1)的基因敲除载体pacC3300转化根癌农杆菌感受态细胞，得到含有敲除载体的根癌农杆菌；

3)将含有敲除载体的根癌农杆菌在含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基上扩大培养至OD600为0.8，然后再转入含有诱导剂的IM培养基培养至OD600为0.5，得到根癌农杆菌菌液；

4)将萌发的意大利青霉制成浓度为1x10⁵/mL的孢子悬浮液；

5)将步骤2)的根癌农杆菌菌液与步骤3)的意大利青霉孢子悬浮液按1:1的体积比混合，在带有承载膜的Co-IM固体培养基上共培养，培养温度25℃，培养时间36h，最后转入含有50ug/ml的潮霉素B和200ug/ml的头孢霉素的PDA培养基中进行抗性培养，筛选获得转化子，

所述pacC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述潮霉素B的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明为了测试野生型意大利青霉对筛选基因潮霉素B的敏感性，开展了意大利青霉对潮霉素B敏感性实验，结果表明潮霉素B>5ug/ml时，可完全抑制意大利青霉的生长，因此可以使用潮霉素B作为筛选标记。

本发明为了探究能介导意大利青霉转化的根癌农杆菌类型，使用AGL-1和GV3101作为农杆菌原料，经为实验，农杆菌AGL-1介导转化得到了许多转化子而GV3101并没有得到转化子，因此所述的用于介导意大利青霉的根癌农杆菌为AGL-1。

本发明为了探究意大利青霉孢子悬浮液的浓度对转化的效率，所述的孢子悬浮液的浓度为1x10⁴-1x10⁷cfu/ml，进行转化实验，更为优选的是1x10⁵cfu/ml。

本发明为了探究共培养的温度对意大利青霉转化的影响，所述的共培养温度为22℃，25℃和28℃，更优选的是25℃。

本发明为了探究IM预诱导农杆菌时乙酰丁香酮的影响，所述的方式为不加乙酰丁香酮和添加乙酰丁香酮，更优选的是添加乙酰丁香酮。

本发明为了探究共培养的时间对意大利青霉转化的影响，所述的共培养时间为12h，24h，36h和48h，更优选的是36h。

本发明对上述方法获得的转化子的遗传稳定性进行了随机抽取，提DNA进行PCR验证，结果表明该方法可稳定遗传。