[发明专利]一种从海洋球石藻中提取叶绿醇的方法

说明书

本发明公开了一种从海洋球石藻中提取叶绿醇的方法,依次以：用乙酸乙酯进行萃取；用反相硅胶柱进行一次层析；用反相硅胶柱进行二次层析；用葡聚糖凝胶柱Sephadex LH‑20进行层析；用正相硅胶柱进行层析；用PTLC制备的方法从海洋球石藻中提取叶绿醇。本发明首次对海洋球石藻乙酸乙酯相提取物的叶绿醇进行了分离、纯化，并对叶绿醇的细胞毒性进行了研究，以便为后续大规模生产叶绿醇奠定基础。

技术领域

本发明涉及生物制剂的技术领域，尤其涉及一种从海洋球石藻中提取叶绿醇的方法。

背景技术

海洋球石藻(Coccolithophores)是一类单细胞海洋微型浮游植物，隶属于定鞭藻门(Haptophyta＝Prymnesiophyta)定鞭藻纲(Prymnesiophyceae)。海洋球石藻代谢产物中富含多种生物活性物质，如二十二碳六烯酸(DHA)、聚酮类化合物等，尤其是海洋微藻细胞中总脂含量最高可达细胞干重的50％，这些化合物具有良好的抑菌、抗氧化、抗肿瘤等生物功能，在生物技术领域具有广阔的应用前景。但目前有关海洋球石藻脂类活性物质领域的研究较少。

有鉴于此，本发明人研究和设计了一种从海洋球石藻中提取叶绿醇的方法，本案由此产生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从海洋球石藻中提取叶绿醇的方法，旨在通过薄层层析法、硅胶柱层析法、凝胶柱层析法、制备型薄层PTLC等方法对海洋球石藻乙酸乙酯相提取物的叶绿醇进行分离、纯化，以便于后续大规模化生产叶绿醇。

为了解决上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种从海洋球石藻中提取叶绿醇的方法,依次以：用乙酸乙酯进行萃取；用反相硅胶柱进行一次层析；用反相硅胶柱进行二次层析；用葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20进行层析；用正相硅胶柱进行层析；用PTLC制备的方法从海洋球石藻中提取叶绿醇。

作为实施例的优选方式，上述提取叶绿醇的方法具体包括以下步骤：

步骤一、制备海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物：先用乙醇溶液浸提，获得乙醇浸膏，再以乙酸乙酯为萃取剂进行萃取处理，合并萃取液，减压浓缩得到海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物；

作为实施例的优选方式，海洋球石藻生长至稳定期，收获，冷冻干燥获得海洋球石藻藻粉，用质量分数为75％的乙醇溶液浸提，获得乙醇浸膏，加入等体积的乙酸乙酯和水，反复萃取，收集乙酸乙酯相，合并、减压浓缩至干，获得海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物；

步骤二、反相硅胶柱层析制备叶绿醇一次粗品：将获得的海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物以反相硅胶柱进行层析处理，收集，检测、合并、减压浓缩至干，得到叶绿醇一次粗品；

作为实施例的优选方式，将海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物用适量的分析纯甲醇溶解，加入量以甲醇正好没过萃取物为宜，进行反相硅胶柱层析；依次用水，质量分数为25％的甲醇溶液，质量分数为50％的甲醇溶液，质量分数为75％的甲醇溶液，甲醇洗脱，每个梯度洗脱1.5L，流速控制为30mL/min，每200mL收集1管，旋蒸，初步用TLC分析流出物，合并叶绿醇高浓度流分段，减压浓缩至干，获得叶绿醇一次粗品；

步骤三、反相硅胶柱层析制备叶绿醇二次粗品：将获得的叶绿醇一次粗品以反相硅胶柱进行层析处理，收集，检测、合并、减压浓缩至干，得到叶绿醇二次粗品；

作为实施例的优选方式，将叶绿醇一次粗品，依次采用质量体积分数为65％，70％，75％，80％，85％的甲醇溶液梯度进行反相硅胶柱层析，每个梯度洗脱300mL，流速控制为30mL/min，每200mL收集1管，旋蒸，初步用TLC分析流出物，合并叶绿醇高浓度流分段，减压浓缩至干，获得叶绿醇二次粗品；