[发明专利]一种利用真核表达系统制备HIV‑1gp120的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学检验领域，涉及针对于HIV的重组抗原、昆虫杆状细胞表达及其用于HIV抗体快速诊断试剂盒的研发，具体涉及一种利用真核表达系统制备HIV-1gp120的方法。

背景技术

获得性免疫缺陷综合征（AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（HIV）引起的，人体感染HIV病毒后会引起机体产生免疫反应，产生相应的抗体。通过检测血液或体液中是否存在HIV抗体，可判断该标本是否感染了HIV病毒。HIV外膜蛋白Env，包括外膜蛋白gp120和穿膜蛋白gp41。Gp120位于HIV包膜表面，不但是病毒粒子的主要结构蛋白之一，也是HIV-1侵袭其靶细胞即人体CD4^＋细胞第一步的物质基础，与HIV-1的吸附、穿入、细胞嗜性、免疫中和、免疫逃避等密切相关。同时gp120上有CD4结合位点和多个抗原决定簇，以及对巨噬细胞和脑组织纤维的特异性识别区，与HIV-1中和抗体应答、特异性细胞毒反应及分子致病机制密切相关，成为AIDS疫苗开发研究的重点。

现有的免疫学诊断技术一般利用抗原—抗体反应来检测抗evn去抗体，这些可与evn区抗体结合的抗原主要是从血液提取、大肠杆菌基因工程表达系统、化学方法多肽合成等方法中获取。

首先，从HIV感染者血液中或从HIV感染后的淋巴细胞裂解液中分离获取的HIV抗原，由于对HIV灭活工艺能否始终保持100%有效性的担忧，无论是对抗原的制备者，还是对抗原的使用者来说，都存在现实或潜在的致病危险性，这一点严重限制了该技术的使用。

其次，通过大肠杆菌表达系统来制备HIV抗原，虽然大肠杆菌表达系统具有很高的表达效率，获得HIV抗原的成本低、安全性好，但该抗原与天然抗原相比较，缺少转录后糖基化修饰，而且通过包涵体方式获得的抗原的空间结构，特别是二硫键位置与天然抗原存在着显著差异，造成抗原活性下降和非特异性上升。而且大肠杆菌表达系统如果表达分子量超过十万道尔顿的蛋白质，会存在表达量低、质粒不稳定的可能。

再者，用合成多肽的化学方法合成HIV抗原，虽然该方法技术成熟、可以大规模的、重复性的生产抗原，但受反应效率和得率的限制，片段长度只能十几个氨基酸残基，无法包括更多的抗原决定簇。同时也无法实现必要的转录后修饰，免疫学活性会受到很大的限制，可能诊断时会对阳性标本有检漏的可能。

而真核表达系统是获取糖基化修饰抗原的主要途径。目前使用比较多的就是杆状病毒表达系统在昆虫细胞内的表达。昆虫细胞作为宿主细胞表达高度特异性的病毒，这些病毒可以引起昆虫流行病，但对脊椎动物是无害的。并且昆虫细胞培养简单，可以高水平的表达蛋白。

因此本发明提供了一种无致病危险、有糖基化修饰和正确空间构象、高水平表达抗原的制备方法，解决了上述不同方面的局限性。

发明内容

本发明为了解决上述问题，提供一种获得gp120抗原纯度高、灵敏度高的利用真核表达系统的备方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种利用真核表达系统制备HIV-1gp120的方法，步骤如下：

A、利用大肠杆菌体外表达系统，获得pFastBac-Ysgp3质粒；

B、利用上述灭活质粒转染昆虫sf9细胞，待细胞病变后收集P1代病毒上清；

C、利用P1代病毒上清再次感染昆虫sf9细胞，获得P2代病毒上清；

D、重复C步骤，依次获得P3、P4代病毒上清；

E、用P4代病毒上清感染昆虫sf9细胞，在gp120表达量出现峰值的时候收集细胞，获得gp120蛋白；

F、纯化gp120蛋白。

优选的是，步骤A中大肠杆菌为DH10Bac细胞，HIV-1gp120杆状病毒体积与细胞数之比为1:100~1:25。

优选的是，步骤F中纯化方法为Ni柱亲和层析法。

本发明具有以下优点：通过基因重组的方法获得gp120的重组抗原，该重组抗原编码基因能够在昆虫细胞中表达，解决了现有HIV-1检测试剂研发过程中存在的无法获得高纯度、高灵敏度的gp120抗原的问题。

具体实施方式

为了加深对发明的理解，下面将结合实施例和对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

一种HIV-1gp120膜蛋白在大肠杆菌内完成Bac to Bac。

本实施例描述了通过宿主菌大肠杆菌构建能表达HIV-1gp120外膜蛋白。