[发明专利]优化的动物蛋白基因OCX-36及其原核表达载体的构建

权利要求书

1.一种优化的动物蛋白基因OCX-36，其特征在于：它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述基因OCX-36编码的蛋白Ovocalyxin-36，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于：它含有权利要求1所述优化的动物蛋白基因OCX-36的表达载体。

4.根据权利要求3所述重组表达载体，其特征在于：所述表达载体为pET28b(+)。

5.根据权利要求4所述重组表达载体，其特征在于：所述优化的动物蛋白基因OCX-36插入表达载体pET28b(+)的酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ之间。

6.含有权利要求3~5中任意一项所述重组表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

7.一种权利要求3~5中任意一项所述重组表达载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）对OCX-36编码基因进行分析，根据大肠杆菌的密码子偏好性，对OCX-36基因进行稀有密码子替换，并调整密码子适应指数，同时切除了21个氨基酸长度的信号肽；得到优化的动物蛋白基因OCX-36，其核苷酸序列如核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2）根据优化的动物蛋白基因OCX-36序列设计特异性引物对，该引物对分别加入保护碱基和相应的限制酶切位点，引物序列分别为：

F- BamHⅠ:CGGGATCCATGAAGCCGCTGAAGCTTTT；

R- EcoRⅠ: CGGAATTCTCACACGGAGATCGCCAACA；

3）以优化的动物蛋白基因OCX-36的序列为模板，进行PCR，得到PCR产物；

4）将PCR产物连接到质粒pMD-19T上，得到质粒pMD-19T-OCX-36，

5）BamHⅠ和EcoRⅠ分别对pMD-19T-OCX-36和pET28b(+)进行双酶切，回收得到酶切化的OCX-36和线性化的pET28b(+)；

6）将酶切化的OCX-36和线性化的pET28b(+)用T4连接酶4℃连接过夜，得到连接产物；

7）将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷IPTG诱导表达；筛选验证，获得重组表达载体和含有重组表达载体的宿主细胞。

8.一种含有重组表达载体的宿主细胞制备蛋白Ovocalyxin-36的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）将权利要求7所述的步骤6）得到连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞；诱导表达；

2）取诱导表达的菌液，加入PBS缓冲液，离心，超声破碎后离心，保留上清液；

5）上清液上样至亲和层析柱，洗脱得到蛋白Ovocalyxin-36，即为蛋白rOCX-36。

9.一种利用权利要求8制备得到的蛋白Ovocalyxin-36在制备抗炎的药品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述蛋白Ovocalyxin-36在制备抗结肠炎的药品中的应用。