[发明专利]优化的动物蛋白基因OCX-36及其原核表达载体的构建

说明书

本发明公开了一种优化的动物蛋白基因OCX‑36及其原核表达载体的构建方法和应用，采取的技术方案是对OCX‑36基因稀有密码子进行改造优化，并切除了信号肽，将优化的OCX‑36基因与载体连接，构建重组质粒pMD‑19T‑OCX‑36，转入到大肠杆菌C41(DE3)感受态细胞中，筛选阳性克隆进行培养、蛋白表达，菌体细胞超声破碎、离心、收集上清液经一次镍柱亲和层析即可获得蛋白rOCX‑36。本发明通过对OCX‑36基因序列的优化，实现了蛋白rOCX‑36的可溶性表达，解决了其难于原核表达的技术问题，表达蛋白对患有结肠炎的小鼠具有明显改善病情的效果，显示rOCX‑36可用于制备治疗结肠炎的药物。

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体地指一种优化的动物蛋白基因OCX-36及其原核表达载体的构建。

背景技术

由于大肠杆菌表达系统具有培养周期短、表达水平高、生产成本低等优点，是基因工程中应用最为广泛的表达系统，成为基因表达的重要工具，尤其是进入后基因组时代以来，有关蛋白结构以及功能研究的开展，对基因表达的要求更高，大肠杆菌往往是表达的第一选择。然而，动物基因在大肠杆菌系统中表达具有很大的难度和不确定性，虽然已有某些动物基因在大肠杆菌系统中实现成功表达，但效果差别很大，方法各不相同，由于是异源表达，外源的基因会被大肠杆菌防御系统识别并降解造成无法表达，诱导条件、外源基因的性质、菌株种类等等诸多因素都会造成目标基因不表达。另外，大肠杆菌系统通常采用的强启动子容易造成蛋白质折叠不正确，形成包涵体，大肠杆菌没有内质网和高尔基体，合成的肽链无法加工成为有活性的蛋白质。

Ovocalyxin-36(OCX-36)是原鸡属(Gallus gallus)特有的基因，出现在鸟类和哺乳动物分化之后，源于人脂多糖结合蛋白/人杀菌通透性增加蛋白/腭肺鼻上皮癌关联蛋白(BPI/LBP/PLUNC)基因簇的顺接重复，氨基酸序列比对搜索结果显示与BPI/LBP/PLUNC家族蛋白有20-25％同源，实验也证明该蛋白具有显著的抗菌活性。同时研究表明OCX-36mRNA的表达发生在蛋壳形成组织，并且在蛋壳形成钙化阶段表达上调，因此OCX-36与生物矿化(如蛋壳形成)息息相关[Ovocalyxin-36and other LBP/BPI/PLUNC-like proteins asmolecular actors of the mechanisms of the avian egg natural defences.BiochemSoc Trans,2011,39:971-976]。

OCX-36是一种前体蛋白，其溶解性较差，并且基因序列中含有串联的稀有密码子，因此作为动物基因的OCX-36在大肠杆菌系统异源表达更加困难，目前国内外还没有关于OCX-36基因体外表达的相关报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供了一种优化的动物蛋白基因OCX-36，该优化基因解决了目前动物蛋白基因OCX-36无法在大肠杆菌系统中表达或者在大肠杆菌系统中不能稳定表达的缺点。

本发明的目的之二是提供了一种优化的动物蛋白基因OCX-36 表达载体的构建方法，该方法通过优化的基因序列成功构建了重组的表达载体。

本发明的目的之三是提供了一种应用，该应用是利用构建的重组的表达载体制备大量、高纯度的可溶性蛋白rOCX-36。

为实现上述目的，本发明提供的一种优化的动物蛋白基因 OCX-36，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明通过对OCX-36基因进行分析，基于大肠杆菌的密码子适应指数(CAI)0.66(一般认为CAI值大于0.8易于表达)，其序列中出现连续的稀有密码子，需要对OCX-36基因序列进行优化，提高表达成功率。

本发明还提供了上述基因OCX-36编码的蛋白Ovocalyxin-36(简写：rOCX-36)，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。