[发明专利]重组表达载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种蛋白OCX-36在制备结膜炎的药品中的应用，其特征在于：所述蛋白OCX-36由以下步骤制备而成：

1)重组表达载体pFastBac1-OCX-36的制备：

a.以SEQ ID NO.1所示OCX-36基因序列设计特异性引物对，该引物对分别加入保护碱基和相应的限制酶切位点，引物序列分别为：

F-XhoⅠ:CGGGATCCATGAAGCCGCTGAAGCTTTT；

R-EcoRⅠ:CGGAATTCTCACACGGAGATCGCCAACA；

b.以动物蛋白基因OCX-36的序列为模板，进行PCR，得到PCR产物；

c.将PCR产物连接到质粒pMD-19T上，得到质粒pMD-19T-OCX-36；

d.XhoⅠ和EcoRⅠ分别对pMD-19T-OCX-36和pFastBac1进行双酶切，回收得到酶切化的OCX-36和线性化的pFastBac1；

e.将酶切化的OCX-36和线性化的pFastBac1用T4连接酶4℃连接过夜，得到连接产物；转化验证，得到重组表达载体pFastBac1-OCX-36；

2)重组杆状病毒Bacmid-OCX-36的制备：

A.将重组表达载体pFastBac1-OCX-36含有Bacmid质粒的E.Coli DH10Bac感受态细胞中，得到重组杆状病毒质粒Bacmid-OCX-36；

B.将对数生长期的昆虫细胞加入到六孔板中，重组杆状病毒质粒Bacmid-OCX-36转染昆虫细胞，培养，离心收集上清，为P1代重组杆状病毒；

C.将得到的P1代重组杆状病毒转染昆虫细胞，表达得到P2代重组杆状病毒；即为重组杆状病毒Bacmid-OCX-36；

3)蛋白OCX-36的制备：

i.取对数生长期悬浮培养的昆虫细胞，重组杆状病毒Bacmid-OCX-36进行转染，离心得到转染病毒的上清液，

ii.将上清液超滤离心管浓缩，上样至亲和层析柱，洗脱目的蛋白，将目的蛋白放入透析过夜，SDS-PAGE和Western Blot检测，即为蛋白OCX-36。