[发明专利]重组表达载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种优化的动物蛋白基因OCX‑36及其原核表达载体的构建方法和应用，采取的技术方案是对OCX‑36基因稀有密码子进行改造优化，并切除了信号肽，将优化的OCX‑36基因与载体连接，构建重组质粒pMD‑19T‑OCX‑36，转入到大肠杆菌C41(DE3)感受态细胞中，筛选阳性克隆进行培养、蛋白表达，菌体细胞超声破碎、离心、收集上清液经一次镍柱亲和层析即可获得蛋白rOCX‑36。本发明通过对OCX‑36基因序列的优化，实现了蛋白rOCX‑36的可溶性表达，解决了其难于原核表达的技术问题，表达蛋白对患有结肠炎的小鼠具有明显改善病情的效果，显示rOCX‑36可用于制备治疗结肠炎的药物。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种重组表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

随着现代生物技术的发展，对各种功能性蛋白质的需求逐年攀升，天然方式获取已经无法满足人类的需求，因此，建立高表达、低成本、安全性高的大规模生产高价值重组蛋白的外源表达系统就显得更加迫切。昆虫杆状病毒表达系统具有高效表达、基因克隆容量大、重组病毒易于筛选、安全性高、且有完备的翻译后加工修饰系统等特点，在生物制药和基因工程等方面具有广阔的应用前景，目前研究及应用最为广泛的是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)。

OCX-36由453个氨基酸组成，其cDNA序列全长1995bp，与人脂多糖结合蛋白/杀菌通透性增加蛋白的结构相似，研究表明，OCX-36可以与金黄色葡萄球菌细胞壁脂磷壁酸结合，抑制金黄色葡萄球菌的生长，参与宿主防御抵御细菌。另一方面，OCX-36在蛋壳钙化时高度表达，对蛋壳碳酸钙晶体的形成及形态具有重要的作用。其三，OCX-36蛋白抗炎效果显著。因此，对OCX-36蛋白的研究不仅可以提高禽蛋质量，减少禽蛋食源性疾病的发生，降低蛋壳破损造成的经济损失，同时还可以应用于医疗领域，由于合成药物不可避免的副作用，食物来源的功能蛋白会是理想的替代品。尽管蛋白质在昆虫细胞表达过程中，糖基化修饰通常缺乏末端唾液酸化，但是OCX-36蛋白发挥功能作用并不是依赖于糖基化，而是其结构中心的脂质结合袋区域。

昆虫杆状病毒表达系统明显的一个缺点是：外源基因受到晚期病毒启动子ETL的调控，尽管强启动子具有很高的效率，但其启动时间较晚，表达产物产量出现峰值时，细胞却由于病毒侵染而即将死亡。获得高滴度的病毒液是大量表达的关键前提，这需要经过数次的病毒扩增的过程，但是病毒扩增的代数不能过多，因为病毒基因组变异较快，通过多次循环感染会产生“继代效应”，即病毒的感染能力下降，会造成收获的重组病毒液中存在大量的突变病毒，导致表达过程中目的蛋白产量的降低。其次，病毒感染的细胞数决定了细胞的生产力，这主要是由感染复数(MOI)起作用，高MOI可以在较短的生产周期得到很高产量，但是也要避免使用过高的MOI，高MOI更容易产生病毒缺损干扰因子，同时也会加速昆虫细胞的死亡，而较高的细胞存活率(95％)才能够保证病毒在细胞内进行有效的繁殖扩增。

昆虫杆状病毒表达系统中，外源基因的可溶性表达是建立在对目的基因的了解基础之上的，包括是否需要进行稀有密码子优化，消除目的基因5’端二级结构，或者3’端添加蛋白标签帮助蛋白折叠等。OCX-36属于分泌型疏水蛋白，为简化实验操作，采取优化表达条件达到高效表达。

发明内容

本发明的目的是提供了一种重组表达载体pFastBac1-OCX-36及其构建方法，该重组表达载体pFastBac1-OCX-36能够成功表达OCX-36蛋白。

本发明提供了一种利用重组表达载体pFastBac1-OCX-36制备重组杆状病毒方法，并利用重组杆状病毒成功表达OCX-36蛋白。

为实现上述目的，本发明提供的一种重组表达载体pFastBac1-OCX-36，所述重组表达载体pFastBac1-OCX-36是由OCX-36基因序列插入表达载体pFastBac1内；所述OCX-36基因序列如SEQ ID NO.1所示。