[发明专利]一种细菌微流控集成检测的方法

说明书

本发明公开了一种细菌微流控集成检测的方法，增菌过程管道化、DNA提取过程管道化和PCR反应过程管道化；将增菌过程管道化中的细管一端插入样本增菌液中进行增菌；增菌结束后，采用传动装置驱动取菌针环，将增菌过程管道化的细管中的菌液转移至DNA提取过程管道化的细管中；所述菌液在DNA提取过程管道化中的细管中进行DNA提取；提取结束后，采用注射泵将DNA提取过程管道化的细管中的提取液转移至PCR反应过程管道化的细管中进行PCR反应；PCR反应结束后，荧光实时检测或通过电泳检测目标产物。该方法可彻底替代细菌检测过程中的人工操作，节约时间和人力成本，能够实现细菌样本的自动化检测。

技术领域

本发明涉及一种细菌微流控集成检测的方法，用于细菌检测的领域。

背景技术

细菌性疾病是一类严重威胁人类健康的疾病，仅细菌性食源性致病菌每年约导致美国360万人患病，3.6万人住院，861人死亡。中国每年细菌性食源性疾病发病人数约9411.7万人次，其中2475.3万患者就诊，335.7万患者因病住院，8530例患者死亡。

致病菌的检测是细菌性疾病预防控制和相关研究的基石，主要检测对象为临床样本和非临床样本(环境、食品和媒介生物体等样本)。分离培养技术是早期出现的致病菌检测技术，以分离和鉴定两个基本步骤为基础，增加增菌步骤，有利于恢复受损菌体和低载量目标菌，同时可抑制竞争性杂菌生长，从而提高检测敏感性。

分离培养技术作为标准方法已被广泛应用于各层级实验室，但其增菌、分离及鉴定的前处理步骤大多需要人工操作，程序较复杂，即使目前有自动化的接种仪器和飞行质谱鉴定设备以及上述两种设备的联用系统等可代替部分人力，但总体上因分离培养技术自身程序的复杂性和昂贵的自动化设备普及性受限，分离培养技术仍需占用大量人力，耗时较长。

为了克服上述不足，在增菌方面，本申请人首次创新性研制了毛细管色谱式增菌法，利用半固体凝胶的分子吸附原理将选择性增菌剂固定于毛细管中作为固定相，以此预制毛细管为“色谱柱”，以样本增菌液混合液为进样源，利用带鞭毛目标菌自身的动力，在毛细管中由进样端向远端高效地将目标菌从混合菌群中色谱式增菌，且同时可实现预增菌与增菌两步合并进行，可节约大量的人力和时间，已获相关授权专利5项。

在分离鉴定方面，致病菌分离培养技术的部分步骤可以被分子生物学检测技术替代，以便于节约人力、加快检测速度。增菌步骤无法由两种技术替代，因两种技术的灵敏性仍有一定局限性(检出限较高)，分子生物学检测技术对不同菌属(种)的检出限为10¹-10³CFU/mL。

分子生物学检测技术的核心部分是聚合酶链式反应(PCR)技术，主要包括普通PCR、实时荧光定量PCR和以及其他基于PCR的技术。目前已有DuPont公司的系列产品、Bio-Rad公司的iQ-系列产品和Thermo Fisher Scientific公司的SureTect^TM系列产品和Cepheid公司的Gene系列产品等实现了一定程度的自动化。但是上述产品均未包括增菌过程，仍需要进行一定的人工辅助操作。

综上所述，对于致病菌检测，毛细管色谱式增菌法一定程度简化了增菌的过程，但仍需配以后续繁杂的分离鉴定步骤。PCR技术在节约人力和降低检测成本方面表现出一定优势，但是仍需要辅以增菌过程，需几步人工辅助。目前细菌的检测仍然过程较为复杂，时间和人力成本占用较多。

发明内容

为了彻底替代细菌检测过程中的人工操作，节约时间和人力成本，本发明旨在提供一种细菌微流控集成检测的方法，能够实现细菌样本的自动化检测。

本发明的技术方案如下所述：

一种细菌微流控集成检测的方法，包括以下步骤：增菌过程管道化、DNA提取过程管道化和PCR反应过程管道化；

所述增菌过程管道化包括以下步骤：配制增菌基质，然后将增菌基质填装入细管中；