[发明专利]一种脂肪酶重组大肠杆菌表达菌株、重组脂肪酶和应用

权利要求书

1.一种重组脂肪酶在植物油脱胶中的应用，其特征在于，以重组大肠杆菌表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制备重组脂肪酶；所述重组大肠杆菌表达菌株由下述方法制得：

(1)将脂肪酶GZEL基因克隆到pFL-B62cl表达载体上，构建得到重组质粒；所述脂肪酶GZEL基因的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；

(2)将所得的重组质粒转化大肠杆菌Shuffle T7感受态细胞，挑选阳性克隆，获得重组大肠杆菌表达菌株。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组脂肪酶的具体制备步骤如下：

①将重组大肠杆菌表达菌株接种于含氨苄青霉素的种子培养基中，于37±2℃，摇瓶培养至对数生长期，制备种子液；

②将所述种子液按5～10％的接种量接种到LB液体发酵培养基中，于37±2℃，摇瓶培养至OD600＝0.6～0.8，再添加IPTG至终浓度10mM，于20℃，摇瓶条件下诱导培养；

③将步骤②中所得发酵液离心，收集菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液重悬并超声破碎细胞，将细胞破碎液离心，取上清，即为重组脂肪酶粗酶液。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将所得重组脂肪酶粗酶液，分别经镍柱亲和层析、G-25脱盐柱纯化和DEAE层析纯化，获得电泳纯的重组脂肪酶酶液。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述镍柱亲和层析所用的洗脱缓冲液为含有150mM咪唑的磷酸盐缓冲液；DEAE层析中所用的洗脱缓冲液为含有200mM NaCl的磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(a)将植物油毛油水浴加热至80℃，加入45％柠檬酸，进行均质处理；

(b)将(a)中处理完的毛油冷却至30～60℃，加入NaOH溶液调节体系pH在4～7之间；

(c)按400～2000U/kg植物毛油的比例加入重组脂肪酶，再加入蒸馏水，酶液和蒸馏水的总体积占油重的2％～5％，混合均匀；

(d)在搅拌条件下，30℃～60℃水浴反应，反应时间为0.5～4h；

(e)将脱胶体系升温至70～100℃灭活酶，离心，保留上层油样，完成脱胶。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(a)所述均质处理的条件为：10000r/min均质1min，80℃水浴、500r/min机械搅拌下维持20min。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(e)所述离心条件为4000r/min，离心5min。

8.根据权利要求1～4任意一项所述的应用，其特征在于，所述植物油为大豆油、菜籽油、花生油、棕榈油、葵花籽油、玉米油和米糠油中的一种或两种以上的混合物。