[发明专利]一种脂肪酶重组大肠杆菌表达菌株、重组脂肪酶和应用

说明书

本发明公开了一种脂肪酶重组大肠杆菌表达菌株、重组脂肪酶和应用，方法如下：(1)将脂肪酶GZEL基因克隆到pFL‑B62cl表达载体上，构建得到重组质粒；所述脂肪酶GZEL基因的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；(2)将所得的重组质粒转化大肠杆菌Shuffle T7感受态细胞，挑选阳性克隆，获得重组大肠杆菌表达菌株。以获得的重组大肠杆菌表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制备重组脂肪酶。本发明酶来源方便，发酵工艺简单、成本低；本发明同时公开了该酶在植物油酶法脱胶中的应用。将所制备的重组脂肪酶在30℃条件下脱胶反应3h即可将毛油中的磷含量降低到10mg/kg以下，与传统酶法脱胶工艺相比，能降低反应能耗。

技术领域

本发明涉及生物技术和油脂加工领域，特别涉及一种脂肪酶的制备方法以及该酶在植物油脱胶中的应用。

背景技术

植物油脂中的胶质主要是磷脂混合物，脱胶是植物油精炼中非常重要的一道工序，脱胶效果好坏将直接影响精炼效率和产品质量。若脱胶不完全，则会加重脱色负担，影响油脂质量和精炼经济效益。

酶法脱胶不仅具有反应条件温和、油损耗低、经济环保等优点，而且采用酶法脱胶精炼的植物油含磷低、口感好、贮藏稳定，因此，以酶法脱胶替代传统的水化脱胶和酸法脱胶，是植物油精炼工业的发展趋势。我国是世界上第四大植物油生产国和第一大植物油消费国，在世界植物油生产、消费和进出口贸易中占有重要地位。但是，目前国内用于植物油酶法脱胶的磷脂酶多依赖进口，价格昂贵，限制了酶法脱胶的大规模应用。基于此，研制出具有我国自主产权、低价、优质、通用性强的酶法脱胶用酶具有重要的战略意义。

在脱胶用酶的开发方面，研究的关注点大都集中在磷脂酶上。应用新型磷脂酶进行油脂中磷脂脱除的酶法脱胶技术也得到了越来越多人的关注。磷脂酶A是目前比较常用的脱胶用酶之一，具体又包含了磷脂酶A1(PLA1)和磷脂酶A1(PLA2)。除此之外，磷脂酶C和磷脂酶B也可以用于磷脂的脱除。最早将酶法脱胶用于大工业生产的是德国Lurgi公司，称为“EnzyMax process”。Novozymes公司也推出了该种酶的商品酶10L，该酶来源于猪的胰脏，属于PLA2。但因其制备数量有限，导致价格昂贵，况且使用时需以钙离子为激活剂，给操作带来极大不便，因此，最终未能得到大规模的推广。随后，Novozymes公司推出Lecitase Novo商品化的脱胶用酶(磷脂酶B)。除此之外，Verenium公司推出了Purifine(商品化的磷脂酶C)，Danisco公司推出了Lysomax Oil(一种类似PLA₂的酰基转移酶)。目前，脂肪酶可用于酶法脱胶的案例还较少，诺维信公司推出的Lecitase Ultra是唯一可商品化用于植物油脱胶的一种脂肪酶。研究发现该酶除了具有脂肪酶活力外，还具有较高的磷脂酶活力，这也是其成功用于脱胶的基础。国内对脱胶用酶的开发，尤其是基于脂肪酶的脱胶用酶开发还处于起步阶段。

GZEL是禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)分泌的一种脂肪酶，据报道该酶在由该菌感染农作物导致镰刀菌属感染所致的头部枯萎病Fusarium Head Blight(FHB)中作为一种毒力因子起重要的作用。虽然已有文献报道该酶的表达方法，但是其所采用的是Pichia pastoris KM71真核表达系统，其采用的是甲醇诱导型的表达方式进行表达，因此，该酶的制备周期较长(单单发酵就需要7天的时间)，耗时耗力，导致所产酶的成本较高。

发明内容

本发明目的之一是提供一种可用于酶法脱胶的重组脂肪酶。对于本发明所提及的GZEL脂肪酶，本课题组首次研究发现，该酶除了具有已报道的脂肪酶活性外，还具有较高的磷脂酶活性，具备脱胶用酶的基本条件。

本发明目的之二是提供一种脂肪酶GZEL重组大肠杆菌表达菌株。在研究过程中，我们还发现，在该酶的大肠杆菌重组表达菌株构建方面，载体的类别及表达菌株的选择对于该酶的高效可溶性表达具有重要的影响，往往会导致无活性的包涵体产生。因此，我们对相关的表达载体和表达菌株进行了筛选和优化组合，最终建立了GZEL大肠杆菌高效重组表达的方法。