[发明专利]双膜法离体培养杨树和双色蜡蘑外生菌根真菌共生体系的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及双膜法离体培养杨树和双色蜡蘑外生菌根真菌共生体系的方法。

背景技术

大多数植物的根系能与共生真菌建立共生，其对植物获取养分和发育至关重要。在北方和温带的森林中，最常见的根际共生是外生菌根（ectomycorrhizae,ECM），例如双色蜡蘑（Laccaria bicolor），即寄主植物的根和某些担子菌和子囊菌物种的菌丝之间的一种动态关系。真菌菌丝侵染寄主树的侧根（Lateral root,LR）顶端并形成ECM，这一种新的复合器官，是两个共生体之间互惠互作的场所。

一些ECM由以下部分组成：（1）广泛的可探测土壤的基质外菌丝网络；（2）一层聚集的菌丝即菌丝鞘在细根周围形成鞘状的储藏室；（3）哈氏网，生长在表皮和皮层细胞之间的菌丝网络，是营养物质和碳水化合物交换的场所。ECM菌根形成包括寄主植物中一系列复杂的发育过程，包括新侧根的形成，寄主植物中的表皮细胞径向扩展，根毛衰减，以及根冠减小。总之，这些形态变化导致ECM的短根表型的特征，而在形态上的准确变化因寄主植物而异。

双色蜡蘑（Laccaria bicolor）菌褶浅紫色至暗色，干后色变浅，直生至稍延生，等长，厚，宽，边沿稍呈波状。秋季生针阔混交林地上，群生或散生。而杨树是阔业落叶乔木,有主干,少旁枝,可作木料和生物能源用,或观赏,由于生命力强，还可以用作种植防护林带。随着世界上对将来可再生能源的需求会越来越大，对杨树的繁殖扩陪和大规模种植的研究越来越多，于是相应地，杨树和双色蜡蘑的共生机制研究也越来越深入。这样迫切需要建立一种培养系统，以方便观察研究，如可以方便组织切片﹑用激光共聚焦等观察哈氏网（Hartig net）﹑容易提取两者的交换物质，以及有利于无污染地从生物组织提取RNA﹑DNA及蛋白质，该共生系统的建立对深入研究其共生的分子机制具有重要应用价值。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种双膜法离体培养杨树和双色蜡蘑外生菌根真菌共生体系的方法的技术方案。

所述的双膜法离体培养杨树和双色蜡蘑外生菌根真菌共生体系的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）杨树插枝培养：杨树插枝在含有吲哚丁酸的MS培养基中培养5-7天，再转移到不含任何激素的MS培养基中培养直至杨树插枝底部形成2-3cm的根；

2）双色蜡蘑培养：将外生菌根真菌双色蜡蘑接种至覆盖在P5培养基上的赛璐玢薄膜上培养直至长出菌丝；

3）共生培养：将步骤1）得到的杨树插枝转移至覆盖在P20培养基上的赛璐玢薄膜上，再取步骤2）得到的带有双色蜡蘑的赛璐玢薄膜面朝下或朝上放在根上，用透气的胶带密封培养皿，用不透光材料遮盖根系部分，然后在24℃,16h光照，8h无光照的条件下培养1-3星期，即可得到共生体系。

所述的双膜法离体培养杨树和双色蜡蘑外生菌根真菌共生体系的方法，其特征在于所述的步骤1）中含有吲哚丁酸的MS培养基中含有：宏量元素50ml/l，微量元素100 ml/l，葡萄糖1.0g/l，维生素10 ml/l，IBA溶液2ml/l，琼脂粉10g/l，所述的IBA溶液浓度为1mg/ml，所述的宏量元素含有硫酸镁3.6mg/mL，硝酸钾38mg/mL，磷酸二氢钾3.4mg/mL，所述的微量元素含有硼酸62ug/ml，氯化钴0.25ug/ml，硫酸铜0.25ug/ml，EDTA钠盐373ug/ml，硫酸亚铁278ug/ml，硫酸锰169ug/ml，硫酸锌86ug/ml，所述的维生素含有肌醇10.0mg/mL，烟酸0.1mg/mL，吡哆醇0.1mg/mL，硫胺素1.0mg/mL。

所述的双膜法离体培养杨树和双色蜡蘑外生菌根真菌共生体系的方法，其特征在于所述的步骤2）中P5培养基含有：麦芽糖5g/l，酒石酸铵0.5g/l，KH₂PO₄ 1.0 g/l，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/l，葡萄糖1.0 g/l，营养液1.0ml/l，维生素B1 1.0 ml/l。