[发明专利]一种微流控芯片荧光免疫快速检测试剂盒及其制备和检测方法

权利要求书

1.一种微流控芯片荧光免疫快速检测试剂盒, 其特征在于：该试剂盒含有微流控芯片，所述微流控芯片包括一条或多条检测单元，所述检测单元位于微流控芯片的半径轴上，以微流控芯片中心点发散排列，所述检测单元自芯片中心点向边缘依次排列有加样槽、荧光探针槽、反应检测槽和废液槽，以及相互连接的微通道，所述荧光探针槽底部固化有荧光探针，该荧光探针是聚苯乙烯荧光（Flu）微球偶联抗体（或抗原或二抗）的复合物；所述反应检测槽中固化有捕获磁珠微球，该捕获磁珠微球是聚苯乙烯磁珠微球偶联抗体（或抗原或二抗）的复合物。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片荧光免疫快速检测试剂盒，其特征在于所述微流控芯片只有加样槽通过加样孔与外界相通，其余槽均是封闭的。

3.根据权利要求1所述的微流控芯片荧光免疫快速检测试剂盒，其特征在于所述加样槽、荧光探针槽、反应检测槽和废液槽的容积相等或不相等，相邻两个槽的间距相等或不相等。

4.根据权利要求1所述的微流控芯片荧光免疫快速检测试剂盒,其特征在于所述微流控芯片的驱动力为离心力。

5.根据权利要求1所述的微流控芯片荧光免疫快速检测试剂盒, 其特征在于所述的聚苯乙烯荧光微球的直径为10～300nm，优选50～200nm；聚苯乙烯荧光微球内包裹荧光物质，所述荧光物质包括罗丹明、异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、镧系元素（钐Sm、铕Eu、钆Gd 、铽Tb等）、量子点等；所述聚苯乙烯磁珠微球的直为1～10um，优选2um～5um，微球内包裹超顺磁四氧化三铁微粒(Mag)，微粒平均直径10nm。

6.根据权利要求1所述的微流控芯片荧光免疫快速检测试剂盒,其特征在于所述微流控芯片是由上下两块板（A板、B板）键合而成，所述微流控芯片材料为石英、玻璃或PDMS、PMMA、PS、PC、COC、COP等高聚物，所述微流控芯片的形状为圆形或外接圆的多边形。

7.根据权利要求1所述的微流控芯片荧光免疫快速检测试剂盒,其特征在于所述微流控芯片中心位置有一与离心机转轴相匹配的固定孔，所述微流控芯片的厚度为4mm～10mm，直径为50～200mm，优选80～100mm，所述槽表面可以是圆形、椭圆形、水滴形或其他不规则形，槽的容积为为5～200ul。

8.根据权利要求1所述的微流控芯片荧光免疫快速检测试剂盒,其特征在于所述检测试剂盒的检测样本为全血、血清、血浆、唾液、痰液、泪液、尿液或其他人体分泌物，以及上述液体的提取液或稀释液或洗脱液；所述检测试剂盒可同时进行1个样品的多因子分别检测，也可同时进行多个样品的1个或多个因子的分别检测。

9.一种权利要求1所述的微流控芯片荧光免疫快速检测试剂盒的制备方法,其特征在于该方法包括如下步骤：

（1）制备A板和B板:

A板和B板含有相互对应的一条或多条检测单元，A板上的检测单元含有加样孔、荧光探针槽上部分、反应检测槽上部分和废液槽上部分，以及相互连接的通道，B板上的检测单元含有与A板相对应的的加样槽、荧光探针槽下部分、反应检测槽下部分和废液槽下部分；

（2）荧光探针聚苯乙烯荧光微球的制备:

取包裹荧光物质的聚苯乙烯荧光微球经洗涤、超声、搅拌处理后,与抗体1（或抗原1或二抗）偶联，加入BSA缓冲液对荧光微球作封闭处理，即得“抗体（或抗原或二抗）-荧光微球”[Ab1（Ag1）-Flu]；

（3）捕获抗体2（或抗原2或二抗）磁性微球的制备:

取聚苯乙烯磁性微球经洗涤、超声、搅拌处理后,与抗体2（或抗原2或二抗）混合，加入BSA缓冲液对微球作封闭处理,即得“捕获抗体（或抗原或二抗）-磁性微球”[Ab2(Ag2)-Mag]；

（4）将“抗体1（或抗原1或二抗）-荧光微球”与“捕获抗体2（或抗原2或二抗）-磁性微球””各1～20ul分别加入到B板的荧光探针槽和反应检测槽中，37°C干燥固化；

（5）采用超声键合机将芯片A、B板键合成一块完整的芯片；

（6）用特殊粘合封口膜将样品孔封闭，封铝箔袋中，即得。

10.一种权利要求1所述的微流控芯片荧光免疫快速检测试剂盒的检测方法,其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)待测物质溶液加入到加样孔中，通过离心驱动待测溶液到达至荧光探针槽并溶解探针微球，待测物质与相应的抗体1(或抗原1或二抗)特异性结合，形成抗原-抗体-荧光微球(Flu -Ab- Ag)复合物；

（2）在离心驱动下，继续将荧光探针槽中的复合物等溶液全部输送至反应检测槽中，并溶解反应检测槽中捕获抗体磁珠微球，溶液中的抗原-抗体-荧光微球1 (Flu -Ab- Ag)复合物与捕获抗体2（或抗原2或二抗）-磁性微球发生特异性免疫反应，形成“荧光微球-抗体1-抗原-抗体2-磁珠微球”的双抗体夹心磁性复合物(Flu –Ab1- Ag –Ab2-Mag)或“荧光微球-抗原1-抗体-抗原2-磁珠微球”的双抗原夹心磁性复合物(Flu –Ag1- Ab-Ag2-Mag)；

（4）在外加磁场的作用下，磁性复合物被吸附在反应检测槽的底部，在离心驱动下，将不含磁性微球的溶液输送到废液池，磁性荧光复合物则留在检测池的底部；

（4）通过加样孔加入清洗缓冲液，离心，清洗反应检测槽中的磁性荧光复合物，加入外磁场，离心去除清洗液，反复操作；

（5）通过荧光检测仪检测，以一定波长的光照射反应检测槽中的磁性荧光微球复合物，检测荧光微球的发光强度，荧光强度与待测物浓度呈相关性。