[发明专利]一种肝素钠的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于动物肠衣提取技术领域，具体涉及一种肝素钠的提取方法。

背景技术

肝素是一种由D-葡糖胺、D-葡糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺和L-艾杜糖醛酸交替组成的酸性黏多糖，广泛存在于哺乳动物肠黏膜、心脏、肝脏、肺、血液、胰腺和胎盘等组织中，具有良好的抗凝血、降血脂、促纤维蛋白溶解、抗中膜平滑肌细胞增殖等方面的活性，被广泛用于心脑血管疾病的治疗。

在肝素提取过程中，通常将其以钠盐的形式制备—肝素钠，便于药效和活性的保存，同时可作为药物制剂使用，其在于临床应用上已具有60多年的历史，但目前仍然只能从动物部分组织中提取，无法通过人工合成制备，其中以小肠黏膜为提取最佳原料；但现有企业通过小肠黏膜提取得到的肝素钠纯度低，收率低。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种肝素钠的提取方法，可有效解决肝素钠提取收率低和纯度低的问题。

一种肝素钠的提取方法，包括以下步骤：

(1)收集新鲜猪小肠黏膜，于0～4℃保存备用；

(2)向小肠黏膜中加入为其重量4～5倍的水，升温至60～65℃，并在升温的同时搅拌分散，保温20～30min，再降温至30～45℃；

(3)向步骤(2)所得的小肠黏膜溶液中加入0.4～0.8％小肠黏膜重量的复合蛋白酶，调节溶液pH值为8.5～9，于40～45℃下酶解3～4h，过滤，收集酶解液Ⅰ和滤渣；以滤渣为底物，重复上述酶解操作，离心，收集酶解液Ⅱ，将酶解液Ⅰ和酶解液Ⅱ合并；

(4)用2～3倍树脂重量的20％～25％氯化钠溶液浸泡树脂，并搅拌2～3h，再分别使用0.5～1.5倍树脂重量的10％氯化钠溶液和5％氯化钠溶液洗脱树脂，每次1～2h；

(5)向合并后的酶解液中加入氯化钠溶液，搅拌混合5～10min，于60～70℃保温10～20min，再加入步骤(4)中处理后的树脂，于室温下搅拌吸附4～6h，搅拌速度为50～100r/min，过滤，分别收集滤液和树脂；并向滤液中加入为其体积6％～8％的氯化钠溶液，再加入过量90％乙醇沉淀，收集并干燥析出物Ⅰ；其中，酶解液与树脂的体积重量比V:M＝12～15；氯化钠溶液体积占酶解液体积的1％～4％；所述氯化钠溶液浓度为0.5～1mol/L；

(6)向树脂中加入1～2倍树脂重量的氯化钠溶液洗脱2～3次，每次3～5h，合并洗脱液，再加入0.4％的胰蛋白酶酶解2～3h，然后等体积95％乙醇沉淀，收集并干燥析出物Ⅱ；

(7)将析出物Ⅰ和析出物Ⅱ混合，加水溶解，再分别加入0.1％混合物重量的过氧化氢和4％～8％混合物重量的单宁酸，搅拌混合，放置5～10min，过滤，然后向滤液中加入等体积的90％乙醇沉淀，收集并干燥析出物，得肝素钠纯品。

进一步地，步骤(3)中复合蛋白酶的重量为小肠黏膜重量的0.4％。

进一步地，步骤(3)中复合蛋白酶包括胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量比为2:1。

进一步地，步骤(5)中氯化钠浓度为0.8mol/L，加入量为1.5％酶解液体积。

进一步地，步骤(5)中树脂为粒径为150～200目的D-254树脂或WD-1701树脂，其粒径为150～200目。

进一步地，步骤(6)中氯化钠溶液浓度为1.6mol/L。

进一步地，步骤(7)中单宁酸的重量为混合物重量的4％。

本发明的有益效果为：

1、复合蛋白酶有助于使小肠黏膜中的肝素提取更加完全，同时，由于溶液中带负电的游离蛋白会与树脂反应，被树脂吸附，因此，在保证提取更加完全的条件下，尽可能少的添加复合蛋白酶，同时在树脂吸附前，高温使蛋白酶变性，降低溶液中游离蛋白的量，提升树脂的吸附率。

2、粒径为150～200目的树脂具有较大的比表面积，其立体空间外侧具有孔径较大的吸水树脂网，另外，使用氯化钠浸泡后的树脂具有更强的渗透性，可有效提升树脂的吸附效率，提升肝素钠的收率。

3、肝素钠被树脂吸附后，浓度为1.6mol/L的氯化钠溶液对肝素钠具有最大洗脱效率。

4、本发明经两次酶解、吸附、解吸附以及再次酶解的工艺提取小肠黏膜内的肝素钠，通过本发明方法，可使肝素钠的收率达到一亿U/1000～1200根小肠，效价可达160U/mg。

5、加入1％混合析出物重量的过氧化氢对析出物进行氧化，使产物氧化彻底，提升产物效价，同时，还可避免产物因过度氧化而导致失活的问题。