[发明专利]鉴定和定量低频体细胞突变的方法有效

专利信息
申请号: 201710381726.8 申请日: 2017-05-25
公开(公告)号: CN108949911B 公开(公告)日: 2022-10-14
发明(设计)人: 魏丽萍;赵博洵;黄岳;伍启熹;叶永鑫;郑夏宁 申请(专利权)人: 北京大学
主分类号: C12Q1/6827 分类号: C12Q1/6827
代理公司: 北京集佳知识产权代理有限公司 11227 代理人: 郑斌;卢蓓
地址: 100871*** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 鉴定 定量 低频 体细胞 突变 方法
【说明书】:

发明提供了鉴定和定量低频体细胞突变的方法,特别涉及鉴定转座子拷贝数和基因组定位的方法。本发明利用不同转座子家族的特异位点,通过构建文库特异性地富集转座子插入序列,利用高通量测序和生物信息学分析,精准的鉴定样本中转座子的基因组定位、拷贝数和类型。使用本发明的方法能够经济地、精准地鉴定转座子的拷贝数和基因组定位。

技术领域

本公开内容涉及基因检测领域。特别地,本公开内容涉及对基因组中低频突变的鉴定和检测,例如对转座子新发插入事件的检测。

背景技术

转座子(Transposon)也称为转座元件(Transposable element),是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。除了在基因组中大量存在以外,转座子在个体中能够以一定频率将其自身序列复制或转移到新的基因组位点。这种转座事件可能影响表型。例如,导致功能基因被破坏的转座事件可能导致疾病(特别是与该功能基因相关的单基因病)。因此,对转座事件的鉴定对于疾病发病机制研究、遗传咨询、诊断和预后具有重要的临床意义。

根据转座的性质,转座子通常可分为两类。第一类转座子称为DNA转座子(DNAtransposon),以剪切-粘贴方式进行转座。该类转座子发生转座后,基因组中转座子的总拷贝数不变。第二类转座子称为反转录转座子(Retrotransposon),以复制-粘贴方式进行转座。它首先转录合成mRNA,之后再次插入基因组反转录回DNA,完成转座过程。这意味着,每发生一次转座,基因组中该转座子的拷贝数就会增加1份。反转录转座子又可分类两类:LTR型和非LTR型,前者的末端具有长末端重复序列(LTR,long terminal repeat),而后者不具有这一结构特征。

根据转座的自主性,转座元件又可以分为自主转座元件和非自主转座元件,前者能够编码转座酶而进行转座,例如L1NE-1转座子家族。后者则需在自主转座元件存在时,通过劫持转座酶完成转座,例如Alu和SVA转座子家族。

LINE-1(Long INterspersed Element-1),或简称L1,是哺乳动物中主要的转座子,也是人类中唯一活跃的自主转座元件类别。LINE-1是非LTR型反转座子,长度约为6kb。在人类基因组中有超过500,000个拷贝的LINE-1序列,但其中绝大多数是不活跃的,只有约80-100个全长L1会活跃地发生转座。

LINE-1的转座事件分为两种:生殖系插入(Germline insertion)事件和体细胞插入(Somatic insertion)事件。前者在亲代生殖系细胞中就已发生,因此存在于子代个体的所有细胞中。相反,体细胞插入事件发生于合子形成后,从早期胚胎发育至终末分化成熟阶段的体细胞中,因此只存在于个体的少数细胞中。因此,体细胞插入事件也称为新发插入(denovo insertion)或细胞特异性插入(Cell-specific insertion)。在人体中,新发体细胞突变的发生频率很低,但却能够导致多种疾病的发生,例如癌症、增生疾病、神经系统疾病等。因此,对新发插入事件的检测具有重要的意义。

目前,新发转座事件的鉴定在技术上还存在很多困难。

首先,新发插入事件无序列特异性。新发插入的转座子与基因组中固有的转座子在基因序列上没有差异,导致无法通过对序列本身的鉴定将二者相区分。

其次,检测背景极高。如上文所述,在单个细胞的基因组中,基因组中转座子序列是大量存在的,而新发插入事件在所有转座子序列中仅占极小的比例。换言之,在对新发插入进行检测时,必须从基因组中极高的固有转座子背景中将新发事件识别出来。同时,在一份组织样品中,可能只有少数细胞带有特定插入这意味着,样品中新发插入事件的信号又会降低二至三个数量级。而且,由于新发插入事件的发生频率很低,就必须对极大数量的细胞群进行测序,才能确保在取样的样品中包含含有新发插入的细胞。也就是说,不可能通过单细胞测序来排除样品中大量参照细胞的干扰。总之,对新发插入事件的检测方法必须有效排除大量其他细胞的高背景噪音以及含有新发插入细胞本身的固有转座子序列带来的高背景噪音。

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