[发明专利]RGDF靶向的新型钌多吡啶配合物载体的制备和评价

说明书

技术领域

本发明涉及序列肽RGDF修饰的钌多吡啶配合物(4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-酰胺-RGDF)双(2,2’-联吡啶)二氯化钌(Ru-CO-RGDF)的制备及 Ru-CO-RGDF/survivin-siRNA基因递送系统的构建，并且对其进行了体内外抗肿瘤活性和基因沉默效率的评价。本专利主要是通过RGDF修饰，增强钌多吡啶配合物的靶向性，使在靶部位的浓度增加，从而减小副作用，提高了治疗指数；

背景技术

目前，癌症已经成为世界第一位致死疾病，治疗癌症是目前科学研究者们的主要目标之一。随着医药和纳米技术的发展，基因治疗癌症成为可能。基因治疗是将外源目的基因通过载体或其它途径导入体内并在靶组织和靶细胞中显示出相应生物学效应从而达到治疗疾病的一种方法。

RNAi(RNA interference)即RNA干涉，是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象,是由双链RNA(dsRNA)介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。但是siRNA存在很多缺点，如本身带有负电荷导致不能穿过细胞膜进入细胞，这类问题的解决成为实现利用RNAi达到基因治疗目的的关键。

Survivin基因编码产生的Survivin蛋白以二聚体的形式存在,是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor ofapoptosis proteins,IAPs)的一种新颖的抗细胞凋亡蛋白因子,也是迄今人们所发现的最强的凋亡抑制因子。

钌配合物与核酸的相互作用研究已经经历了近三十年的历史，其研究成果目前主要用于以下几个方面：核酸结构探针、核酸分子光开关、pH传感器、化学核酸酶、基因治疗、抗癌药物。目前钌多吡啶配合物Ru-COOH的制备是通过加热回流合成的，其粒径在50-70nm左右，其化学形状稳定，形状为较规则的球形，其具备一般纳米材料的特性，其表面有羧基基团，为化学修饰提供了丰富的反应位点，因此可实现钌多吡啶配合物Ru-COOH的修饰来增加其靶向性。

RGDF是一种含“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”氨基酸序列的多肽，可识别肿瘤细胞表面特异表达的整合素，并与其特异性结合从而来介导肿瘤的靶向治疗。经过RGDF序列肽修饰的抗肿瘤药物及其递送系统，可增加药物的主动靶向性，从而达到特异性治疗的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有靶向性的基因载体，Ru-CO-RGDF。

本发明所述基因载体Ru-CO-RGDF的制备方法，包括以下步骤：合成4’- 甲基-2,2’-联吡啶-4-甲酸与H-R(Tos)-G-D(OBzl)-F-OBzl通过DCC/HoBt法缩合后，再经过强酸脱保护，最后与双(2,2’-联吡啶)二氯化钌缩合，即得。

本发明的另一个目的在于提供一种基因递送系统，由基因载体Ru-CO-RGD F和抗肿瘤基因治疗药物survivin-siRNA制备而成。

本发明所述的基因递送系统，基因载体Ru-CO-RGDF和抗肿瘤基因治疗药物survivin-siRNA的重量比为1.66:1。

本发明所述的基因递送系统，为纳米结构。

本发明另一个目的在于提供基因递送系统的制备方法。

本发明所述的制备方法，包括以下步骤：基因载体Ru-CO-RGDF与鱼精蛋白在常温下混合，静置待用，取抗肿瘤基因survivin-siRNA与DNA在常温下混合，室温待用，将上述两者溶液混合后，即得Ru-CO-RGDF/survivin-siRNA。

其中，Ru-CO-RGDF由以下方法制备而成：4’-甲基-(2,2’-联吡啶)-4-羧酸与 H-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl在THF与少量DMF中通过DDC/HOBt反应，然后再脱掉保护基团，最后与顺式-双(2,2'-联吡啶)二氯化钌在加热回流，氮气保护下反应8小时得到Ru-CO-RGDF。

优选的，Ru-CO-RGDF由以下方法制备而成:

1)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl的合成