[发明专利]皱纹盘鲍硫氧还蛋白过氧化酶及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶及其编码的基因与应用，特别涉及一种皱纹盘鲍的基因工程表达，具体涉及一种皱纹盘鲍硫氧还蛋白过氧化酶(TPX)及其制备方法和应用。

背景技术

硫氧还蛋白过氧化酶(thioredoxinperoxidase，TPX)是过氧化物还原酶家族的一员，是过氧化物酶超家族的新成员，广泛存在于自然界中，能够清除体内的多种自由基，维持体内环境平衡。硫氧还蛋白过氧化酶中TPX1、TPX2、TPX6均位于胞浆中；TPX3存在于线粒体；TPX4位于内质网和细胞外基质；TPX5则分布在过氧化物酶体内。其含有一个或者二个半胱氨酸残基，其主要分为六种类型：前五种同工酶均含有二个半胱氨酸残基，第六种同工酶则含有一个半胱氨酸残基。具有相同数量的半胱氨酸残基，它们的同源性较高。在体内参与细胞的许多生理生化反应：作为细胞传递的信号、对细胞增殖和分化起调控作用等。而且由于TPX2天然的抗氧化性能，可用于开发抗氧化性食品、医药制备等领域。

皱纹盘鲍(H.discus hannai Ino)隶属于软体动物门(Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、前鳃亚纲(Prosobranchia)、原始腹足目(Archaeogastropoda)、鲍科(Haliotidae)，以其丰富的营养价值在民间一直被认为是与鱼翅、燕窝齐名的营养食品。目前，已有的对鲍药用及食用价值的研究主要集中在多肽与多糖的提取制备及其生物活性研究。海洋生物因其特殊的生活环境和代谢方式，体内存在许多具有药用价值的特殊生理活性物质，是开发新型海洋药物和功能食品的重要资源。福建省皱纹盘鲍资源丰富、产量大，至2013年，鲍产量达到88470t，所占比例超过全国产量的80％。鲍产业已成为福建省海水养殖的支柱产业之一，也是水产业增长速度最快、经济效益最好的产业。如何充分高效地利用鲍资源，挖掘其中的生物活性物质往保健食品和海洋药物方向高值化利用，符合我省和我国当今新兴的海洋战略发展研究。

对于硫氧还蛋白过氧化酶的直接分离提取工艺相对复杂；而化学合成成本过高且难以保持其天然结构。基因工程以及蛋白质工程的应用为获得天然活性肽开辟了有效途径。基因工程制备生物活性肽克服了直接从动、植物原料中提取抗氧化蛋白筛选的盲目性，纯化工艺简单，便于规模化生产，具有很好的产业化前景。

发明内容

本发明的目的在于提供皱纹盘鲍硫氧还蛋白过氧化酶Hdh TPX2的制备方法以其在制备食品、医药和化妆品等领域的应用。

具体而言，本发明提供了如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种编码皱纹盘鲍硫氧还蛋白过氧化酶的基因，含有SEQ ID NO.1所述的碱基序列或者含有编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有硫氧还蛋白过氧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

优选的，根据以上所述的基因，其中用于所述基因扩增的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

第二方面，本发明还提供了一种皱纹盘鲍硫氧还蛋白过氧化酶，含有以上所述的编码超氧化物歧化酶的基因所编码。

第三方面，本发明提供了一种表达皱纹盘鲍硫氧还蛋白过氧化酶基因的载体，所述载体为含有以上所述的硫氧还蛋白过氧化酶基因、AOX1启动子和终止子序列、多克隆位点以及筛选标志的毕赤酵母表达载体，所述毕赤酵母表达载体优选为pPIC9K。

优选的，根据以上所述的载体，所述硫氧还蛋白过氧化酶基因位于毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点处SnaB Ⅰ和Not Ⅰ限制性内切酶酶切位点之间。

优选的，根据以上所述的载体，所述筛选标志为6×His-tag标签。

本发明还提供了一种皱纹盘鲍硫氧还蛋白过氧化酶制备方法，包括以下步骤：

(1)构建含有编码皱纹盘鲍硫氧还蛋白过氧化酶的基因的重组表达载体；

(2)将步骤(1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得可表达皱纹盘鲍硫氧还蛋白过氧化酶的基因工程菌菌株；

(3)发酵培养已得到的基因工程菌菌株并进行诱导表达，获得表达产物；

(4)分离纯化步骤(3)所得的表达产物，获得重组蛋白，皱纹盘鲍硫氧还蛋白过氧化酶；

其中，步骤(1)中所述编码皱纹盘鲍硫氧还蛋白过氧化酶的基因，含有SEQ ID NO.1所述的碱基序列或者含有编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：