[发明专利]一种绵羊精液常温保存稀释液的实验方法

权利要求书

1.一种绵羊精液常温保存稀释液的实验方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)、提取绵羊的新鲜精液，并将提取的新鲜精液放进集精杯中；

2)、将步骤1)中盛有精液的集精杯放在保温桶水浴，并将提取的精液运回至实验室，运输过程中防止保温桶剧烈震荡；

3)、准备制作稀释液的原材料，Tris、柠檬酸、乳糖、花青素、VC、青霉素和链霉素；

4)、采用步骤1)中的原材料分别配制以下四种稀释液，其中稀释液I的配方为Tris1.92g，柠檬酸1.02g，乳糖0.10g，花青素0.031g，VC0.1g，青霉素0.06g，链霉素0.06g；稀释液II的配方为Tris2.64g，柠檬酸1.52g，乳糖0.36g，花青素0.096g，VC0.1g，青霉素0.06g，链霉素0.06g；稀释液III的配方为Tris3.00g，柠檬酸1.65g，乳糖0.57g，花青素0.132g，VC0.1g，青霉素0.06g，链霉素0.06g；稀释液III的配方为Tris3.00g，柠檬酸1.65g，乳糖0.57g，花青素0.132g，VC0.1g，青霉素0.06g，链霉素0.06g，稀释液IV的配方为Tris3.53g，柠檬酸1.90g，乳糖1.01g，花青素0.204g，VC0.1g，青霉素0.06g，链霉素0.06g；

5)、将步骤4)制作的稀释液放在37℃水浴锅中，使稀释液的温度升温到37℃，并使鲜精温度和稀释液温度一致，达到温度的平衡；

6)、对步骤2)中的鲜精进行稀释，取0.4mL鲜精加入到塑料离心管中，然后往离心管中缓慢加入1.6mL等温的稀释液I，得到稀释精液I，之后再取0.4mL鲜精加入到另一只新的塑料离心管中，然后往离心管中缓慢加入1.6mL等温的稀释液II，得到稀释精液II，依次制作稀释精液III与稀释精液IV；

7)、对步骤6)中稀释精液I、II、III、IV进行保存，将离心管盖盖紧后放在泡沫的离心管架，室温放置保存；

8)、对步骤7)中四组保存的稀释精液中的精子活率进行测定，先将分层的精液用移液枪轻轻吹打混匀，静止5min后，吸取10μL稀释精液I滴在37℃的载玻片上，盖上盖玻片，置400×光学显微镜下进行观察确定，至少观察5个不同视野，每个视野观察20个精子，记录存活精子数，算出精子活率，运动的精子占精子总数的比例即为精子活力，精子中呈直线运动的精子数占精子总数的百分比即为精子活率，然后依次对稀释精液II、III、IV的精子活率进行测定；

9)、对步骤7)中四组保存的稀释精液中的精子顶体完整率进行检查，取5μL稀释精液I滴在37℃的载玻片然后加入5μL PBS液稀释，将精子密度调整为每毫升1×10⁶个，在载玻片上涂片，采用烘片机烘干，然后滴加6.8％重铬酸钾固定30min，用自来水流水冲洗固定液，自然晾干，然后用瑞士-吉姆萨染色混合液染色1.5h，再次用自来水流水冲洗染液，自然晾干，放在400×显微镜下观察200个精子，计数顶体完整的精子数量，计算出顶体完整率，然后依次计算出稀释精液II、III、IV中的精子顶体完整率；

10)、对步骤7)中四组保存的稀释精液中的精子质膜完整率进行检测，取10μL稀释精液I用PBS液稀释，将精子密度调整为每毫升1×10⁶个，孵育后取10μL调整后的悬液滴于血细胞计数板，在400×光学显微镜下观察，计算弯尾占总精子数的百分率，其中精子尾部弯尾就是精子质膜完整率，然后依次对稀释精液II、III、IV中的精子质膜完整率进行计算。

2.根据权利要求1所述的一种绵羊精液常温保存稀释液的实验方法，其特征在于：所述步骤1)中提取精液的对象为多浪羊和策勒黑羊公羊。

3.根据权利要求1所述的一种绵羊精液常温保存稀释液的实验方法，其特征在于：所述步骤2)中保温桶水浴的温度为37℃。

4.根据权利要求1所述的一种绵羊精液常温保存稀释液的实验方法，其特征在于：所述步骤2)中运输时间不能超过半小时。

5.根据权利要求1所述的一种绵羊精液常温保存稀释液的实验方法，其特征在于：所述步骤6)中加稀释液时沿着离心管的管壁将稀释液加入精液，边加边混匀。