[发明专利]一种绵羊精液常温保存稀释液的实验方法在审

专利信息
申请号: 201710387339.5 申请日: 2017-05-27
公开(公告)号: CN107041363A 公开(公告)日: 2017-08-15
发明(设计)人: 王惠娥;焦海红;汪澜;张强;支松;贾珊珊;芮雪 申请(专利权)人: 塔里木大学
主分类号: A01N1/02 分类号: A01N1/02
代理公司: 北京华仲龙腾专利代理事务所(普通合伙)11548 代理人: 李静
地址: 843300 新疆维吾尔*** 国省代码: 新疆;65
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摘要:
搜索关键词: 一种 绵羊 精液 常温 保存 稀释液 实验 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及绵羊精液常温保存稀释液的实验方法技术领域,具体为一种绵羊精液常温保存稀释液的实验方法。

背景技术

绵羊精液保存技术自发明以来,成为提高优良种畜利用率、加速品种改良最有效之一,而且能降低繁殖成本,对人工授精技术的推广应用,对养羊业的发展都产生了巨大的推动作用。精液的保存方法分为冷冻保存、低温保存和常温保存。

冷冻保存是为了品种资源的保存和地域间种质交流,可长期保持;低温保存(0~5℃)和常温保存(15~25℃)可以扩大精液量,提高种畜利用率,方法简单,但保存时间短。

目前,绵羊人工授精所用精液仍多为鲜精,其原因是绵羊的精液冷冻保存效果不尽理想,尚难在生产上推广的现状下,液态保存精液有很大的应用前景。

现有的绵羊精液常温保存稀释液的实验方法中,稀释液成分大多比较复杂、繁多,保存效果也并不十分理想,保存时间一般在5~72小时,降低了优良种公羊利用率,增加养羊成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绵羊精液常温保存稀释液的实验方法,以解决上述背景技术中提出的稀释液成分大多比较复杂、繁多,保存效果也并不十分理想,保存时间一般在5~72小时,降低了优良种公羊利用率,增加养羊成本的问题。

为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:一种绵羊精液常温保存稀释液的实验方法,包括以下步骤:

1)、提取绵羊的新鲜精液,并将提取的新鲜精液放进集精杯中;

2)、将步骤1)中盛有精液的集精杯放在保温桶水浴,并将提取的精液运回至实验室,运输过程中防止保温桶剧烈震荡;

3)、准备制作稀释液的原材料,Tris、柠檬酸、乳糖、花青素、VC、青霉素和链霉素;

4)、采用步骤1)中的原材料分别配制以下四种稀释液,其中稀释液I的配方为 Tris1.92g,柠檬酸1.02g,乳糖0.10g,花青素0.031g,VC0.1g,青霉素0.06g,链霉素0.06g;稀释液II的配方为Tris2.64g,柠檬酸1.52g,乳糖0.36g,花青素0.096g,VC0.1g,青霉素0.06g,链霉素0.06g;稀释液III的配方为 Tris3.00g,柠檬酸1.65g,乳糖0.57g,花青素0.132g,VC0.1g,青霉素0.06g,链霉素0.06g;稀释液III的配方为Tris3.00g,柠檬酸1.65g,乳糖0.57g,花青素0.132g,VC0.1g,青霉素0.06g,链霉素0.06g,稀释液IV的配方为 Tris3.53g,柠檬酸1.90g,乳糖1.01g,花青素0.204g,VC0.1g,青霉素0.06g,链霉素0.06g;

5)、将步骤4)制作的稀释液放在37℃水浴锅中,使稀释液的温度升温到37℃,并使鲜精温度和稀释液温度一致,达到温度的平衡;

6)、对步骤2)中的鲜精进行稀释,取0.4mL鲜精加入到塑料离心管中,然后往离心管中缓慢加入1.6mL等温的稀释液I,得到稀释精液I,之后再取0.4mL鲜精加入到另一只新的塑料离心管中,然后往离心管中缓慢加入1.6mL等温的稀释液II,得到稀释精液II,依次制作稀释精液III与稀释精液IV;

7)、对步骤6)中稀释精液I、II、III、IV进行保存,将离心管盖盖紧后放在泡沫的离心管架,室温放置保存;

8)、对步骤7)中四组保存的稀释精液中的精子活率进行测定,先将分层的精液用移液枪轻轻吹打混匀,静止5min后,吸取10μL稀释精液I滴在37℃的载玻片上,盖上盖玻片,置400×光学显微镜下进行观察确定,至少观察5个不同视野,每个视野观察20个精子,记录存活精子数,算出精子活率,运动的精子占精子总数的比例即为精子活力,精子中呈直线运动的精子数占精子总数的百分比即为精子活率,然后依次对稀释精液II、III、IV的精子活率进行测定;

9)、对步骤7)中四组保存的稀释精液中的精子顶体完整率进行检查,取5μL 稀释精液I滴在37℃的载玻片然后加入5μL PBS液稀释,将精子密度调整为每毫升1×106个,在载玻片上涂片,采用烘片机烘干,然后滴加6.8%重铬酸钾固定30min,用自来水流水冲洗固定液,自然晾干,然后用瑞士-吉姆萨染色混合液染色1.5h,再次用自来水流水冲洗染液,自然晾干,放在400×显微镜下观察200个精子,计数顶体完整的精子数量,计算出顶体完整率,然后依次计算出稀释精液II、III、IV中的精子顶体完整率;

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