[发明专利]一种P蛋白突变构建的基因VII型新城疫病毒弱毒株

说明书

本发明提供一种P蛋白突变构建的基因VII型新城疫病毒弱毒株，是将VII型新城疫病毒的P蛋白的237位和240位的氨基酸分别突变为苏氨酸T和异亮氨酸I。本发明所提供的弱毒株用于制备疫苗。本发明构建的基因VII型新城疫病毒弱毒株制备的疫苗均能诱导产生较高的中和抗体，能抵抗强毒力基因VII型新城疫病毒的侵害，有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于疫苗病毒株构建技术领域，具体涉及一种P蛋白突变构建的基因VII型新城疫病毒弱毒株。

技术背景

新城疫是由新城疫病毒引起的一种急性烈性传染病，对养禽业的危害极大，曾经被国际兽疫局(OIE)列为A类病。ND于1926年首先被发现于印度尼西亚爪哇，同年发现于英国的纽卡斯尔城，此后迅速向世界各地传播。目前ND已在世界范围内发生了四次大流行，并且宿主范围不断扩大。

刘秀梵等对1985‐2003年分离自江苏浙江地区的29株新城疫病毒进行序列分析，结果显示有17株属于基因VII型，其中10株分离自发病鹅群。刘华雷等对2005年分离自中国大陆地区的83株新城疫病毒进行分析显示，其中64株属于基因VII型。Lien等对2003‐2006年间分离自台湾地区的20株新城疫病毒均为基因VII型。此外同阶段中国周边的韩国和日本流行的NDV也大都为基因VII型。我们对本实验室近年分离的部分NDV毒株也进行了测序分析，结果显示，70％以上的毒株为基因VII型。由此看出，基因VII型新城疫病毒在中国禽群中广泛流行，是目前的绝对优势基因型。

当前市场上对新城疫病毒的防控主要使用IV系疫苗株Lasota、clone30和II系疫苗株B1等基因II型的毒株，它们虽然可以提供一定的免疫保护，但是不能完全阻止新城疫病毒的传播、扩散，特别是基因VII型新城疫病毒的流行给养殖业造成了巨大的经济损失。由于流行的基因VII型新城疫病毒都是强毒，因此大多数毒株不适合作为疫苗株使用，除非是自然弱毒株或是基因工程手段人工致弱的毒株。获得弱毒株是生产疫苗的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种P蛋白突变构建的基因VII型新城疫病毒弱毒株，能用于制备基因VII型新城疫病毒疫苗，从而弥补现有技术中缺少弱毒株的缺陷。

本发明所提供的弱毒株，是将VII型新城疫病毒的P蛋白的237位和240位的氨基酸分别突变为苏氨酸T和异亮氨酸I。

所述的弱毒株，其一种构建方法是通过反向遗传操作方法来构建的，其包括如下的步骤：

构建表达T7RNA聚合酶的细胞系、

所述的细胞系，是将表达T7RNA聚合酶的基因与载体PCI‐neo连接后转染DF1细胞获得的；

提供基因VII型新城疫病毒NDV拯救过程中需要的三个辅助重组质粒和一个全基因组重组载体，三个辅助重组质粒分别包含NDV的NP蛋白、P蛋白和L蛋白基因；其中P蛋白的237位和240位的氨基酸分别为T和I；

将三个辅助重组质粒和一个全基因组重组载体转入到表达T7RNA聚合酶的细胞系中，培养获得基因VII型新城疫病毒弱毒株。

作为优选，所述的弱毒株为基因VII型新城疫病毒rSL‐P株，其于2017年3月20日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201710；

本发明所提供的弱毒株用于制备疫苗。

本发明构建的基因VII型新城疫病毒弱毒株制备的疫苗均能诱导产生较高的中和抗体，能抵抗强毒力基因VII型新城疫病毒的侵害，有广阔的应用前景。

附图说明

图1：新城疫F基因片段PCR鉴定图；

图2：NDV毒株(WF株、SL株)基于F基因片段的系统发生树；