[发明专利]特异性人EWS‑FLI1融合蛋白抗体的制备方法及在制备尤文肉瘤诊断抗体试剂的应用

权利要求书

1.一种特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法，其特征在于，步骤如下：

多肽设计， 设计两组多肽序列，每组共三条，分别为：

组1：多肽1：Cys-SSSYGQQNPSYDSVR；多肽2：SSSYGQQ-Cys；多肽3：Cys-PSYDSVR；

组2：多肽4：Cys-SSSYGQQSSLLAYN；多肽5：同多肽2；多肽6：Cys-SSLLAYN；

多肽合成：多肽纯度≥70%；

抗原制备：将多肽1与多肽4分别与KLH偶联，偶联物作为抗原用于免疫动物；KLH使用琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物双功能偶联剂预先活化成KLH-SMCC，通过半胱氨酸与多肽1相联接；

免疫：选用新西兰兔，每只兔子以300μg剂量进行基础免疫，以后每隔21天进行一次加强免疫，在经过三次加强免疫后，再经7天，取血样，对血清进行ELISA检测；收集经ELISA检测阳性的兔子血清；

抗体纯化；

浓缩：将纯化好的穿透液浓缩成特定浓度目标抗体浓液，1mg/ml以上；

7）抗体鉴定：制备的目标抗体经过酶联免疫法、斑点杂交法法鉴定，证明组1目标抗体只对多肽1有特异反应，对其它多肽均无反应；组2目标抗体只对多肽4有特异反应，对其它多肽均无反应。

2.根据权利要求1所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法，其特征在于，步骤1）所述的多肽具有以下特征：

a) 多肽1为15aa肽，对应人EWS-FLI1 type 1融合蛋白位置aa264-278；多肽序列选择恰为人EWS-FLI1 type 1融合蛋白的拼接位置，其中SSSYGQQ序列来自人EWS，PSYDSVR序列来自人FLI1，中间N为拼接位点；多肽序列在N端人为添加一个半胱氨酸用于抗原偶联；

b) 多肽2为7aa肽，对应融合前人EWS融合蛋白aa258-264，对应多肽1的N端序列，并在多肽2的C端人为添加一个半胱氨酸用于抗原偶联；

多肽3为7aa肽，对应融合前人FLI1融合蛋白aa220-226，对应多肽1的C端序列，并在多肽3的N端人为添加一个半胱氨酸用于抗原偶联；

多肽4为14aa肽，对应人EWS-FLI1 type 2融合蛋白位置aa264-278；多肽序列选择恰为人EWS-FLI1 type 2融合蛋白的拼接位置，其中SSSYGQQ序列来自人EWS，SSLLAYN序列来自人FLI1；多肽序列在N端人为添加一个半胱氨酸用于抗原偶联；

多肽5序列同多肽 2，对应多肽4的N端序列；

多肽6为7aa肽，对应融合前人FLI1融合蛋白aa197-203，对应多肽4的C端序列，并在多肽6的N端人为添加一个半胱氨酸用于抗原偶联。

3.根据权利要求1所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述多肽2与多肽3，多肽5与多肽6的半胱氨酸添加在多肽上的位置不同，以便于抗体纯化。

4.根据权利要求1所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法，其特征在于，步骤2) 所合成的多肽纯度≥85%，分子量正确。