[发明专利]特异性人EWS‑FLI1融合蛋白抗体的制备方法及在制备尤文肉瘤诊断抗体试剂的应用

说明书

技术领域

本发明专利涉及一种人类融合蛋白的抗体制备及应用方法。具体涉及到一种特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法及其在制备恶性肿瘤--尤文肉瘤诊断抗体试剂中的应用。本方法制备的抗体，只对人EWS与FLI1蛋白融合后的人EWS-FLI1融合蛋白有特异反应，对人EWS或FLI1蛋白无反应。

技术背景

尤文肉瘤是一种高度恶性骨肿瘤，其发病率在儿童及青少年原发恶性骨肿瘤中仅次于骨肉瘤。尤文肉瘤根治术后较高的复发与转移率已成为制约尤文肉瘤（Ewing's sarcoma）疗效提高的关键性障碍。目前发现，尤文肉瘤具有特异的染色体易位t（11；22）（q24；q12），重排的22号染色体上EWS基因的3’端与FLI1基因的5’端相结合，产生一个新的融合基因，编码的融合蛋白EWS-FLI1诱导一系列基因的异常表达导致了尤文肉瘤的发生和发展。95%的尤文肉瘤家族具有特异的融合蛋白EWS-FLI1，此蛋白是尤文肉瘤发生、发展的关键，同时也是治疗尤文肉瘤理想的特异性靶点。实验证实EWS-FLI1基因修饰的树突状细胞对尤文肉瘤细胞具有特异性杀伤作用，提示EWS-FLI1可能是EWS细胞的特异性抗原成分。

EWS-FLI1融合蛋白是由EWS的氨基末端和FLI1的羧基末端组合而成，作为调节异常的转录因子EWS-FLI1发挥着强大的致癌基因作用。除了EWS氨基末端的反式激活结构域之外，富含脯胺酸结构域的FLI1羧基末端能显著增强EWS-FLI1融合蛋白的转录活性（Rekhi B, et al. J Postgrad Med, 2010, 56(3): 201-205.）。然而目前对于EWS-FLI1融合蛋白的非转录功能还缺乏研究。研究表明，EWS-FLI1的致癌过程是与DNA结合而非依赖的方式来实现的，因为在尤文肉瘤细胞中发现EWS-FLI1与DNA结合并不能增加前者的致癌潜能。另外有研究发现，EWS-FLI1还能结合靶基因启动子的GGAA卫星重复序列（GGAA-microsatellite repeat sequences），CAV1和GSTM4参与EWS-FLI1介导的肿瘤形成，进一步证实在尤文肉瘤的肿瘤形成过程中，EWS-FLI1的转录活性是通过卫星重复序列来完成的。 EWS-FLI1融合蛋白有多种类型（type），其中两种占绝大多数。其中最普通的类型为型1（EWS-FLI1 type 1），约占60%。与其它的融合类型相比，EWS-FLI1 型1编码功能较弱的反式激活因子，对预后有利。 其次是型2（EWS-FLI1 type 2），约占25%，编码功能较强的反式激活因子，对预后不利。

融合基因是指将两个或多个基因的编码区首尾相连．置于同一套调控序列（包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等）控制之下，构成的嵌合基因，融合基因的表达产物为融合蛋白。融合基因大部分在肿瘤中被发现，并在肿瘤诊断中占有重要的意义。比如早期发现的bcr-abl融合基因在白血病分型中就极为重要。目前，融合基因的检测方法，主要通过在位杂交荧光(FISH)，反转录PCR（RT-PCR）等方法。这些方法主要基于分子生物学法，无法检测表达产物即融合蛋白。而在生物体内，正是其表达产物即融合蛋白在起着生物学效应。本发明基于免疫学方法，可以对表达产物，即融合后的蛋白进行准确地鉴定，可以定性或定量，特异性好，与未融合的蛋白无反应，可以为尤文肉瘤的科研、诊断与治疗提供新的工具。

对于普通的人EWS或FLI1蛋白的抗体，现有技术中已有标准的生产程序，但是，所生产的这些抗体只能识别未融合前的人EWS或FLI1蛋白，或者只能在识别融合前的EWS或FLI1蛋白的众多异构体的同时，附带识别EWS-FLI1融合蛋白，造成检测结果不可靠，非特异性极高。在报道中，EWS至少有6种异构体，FLI1至少4种异构体，EWS-FLI1融合蛋白至少有12种异构体。同时，因为无法准确识别EWS-FLI1融合蛋白的类型，就无法对临床提供准确的预后的判断。

发明内容