[发明专利]一种利用分子标记鉴别黑唇苜蓿盲蝽种群的方法

权利要求书

1.用于鉴定黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocoris ngritylus)种群的特异性引物组合，其特征在于，所述特异性引物组合包括两个引物对，分别以黑唇苜蓿盲蝽线粒体细胞色素氧化酶I基因和线粒体NADH脱氢酶亚基4基因为靶序列，引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.3-4所示。

2.权利要求1所述的特异性引物组合在制备鉴定黑唇苜蓿盲蝽种群试剂盒中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的种群为东北种群和华北种群。

4.一种鉴定黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocoris ngritylus)种群的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的特异性引物组合。

5.根据权利要求4所示的试剂盒，其特征在于，还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。

6.一种利用分子标记鉴别黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocoris ngritylus)种群的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取黑唇苜蓿盲蝽基因组DNA；

(2)以步骤(1)中提取的DNA样品为模板，利用权利要求1所述的特异性引物组合分别进行PCR扩增反应；

(3)两次PCR产物纯化，测序，串联，分析。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，25μL的PCR反应体系为：2×Taq PCR Master Mix反应缓冲液12.5μL，10μM上、下游引物各1μL，DNA模板2μL，无菌水补足至25μL。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，退火温度下退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min；

所述退火温度为当检测引物为SEQ ID NO.1-2时，退火温度为49℃，当检测引物为SEQ ID NO.3-4时，退火温度为59.5℃。

9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中分别对PCR产物进行纯化和测序后，将测序结果按照COI-ND4进行串联拼接，串联序列长度为1763bp，当第144、690、1188、1676、1704bp处碱基依次为A、A、T、T、A时，待测样品为黑唇苜蓿盲蝽东北种群；当第144、690、1188、1676、1704bp处碱基依次为G、G、C、G、T时，待测样品为黑唇苜蓿盲蝽华北种群。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，当碱基第81位为A，或第687位为T，或第822位为G，或第1127位为G，或第1257位为G，或第1617位为A，则待测样品为黑唇苜蓿盲蝽东北种群；当碱基第81位为G，或第687位为C，或第822位为A，或第1127位为A，或第1257位为A，或第1617位为G，则待测样品为黑唇苜蓿盲蝽华北种群。